劉永智

RhoA在乳腺癌中表達(dá)的研究

劉永智

目的 探討RhoA在人乳腺癌中表達(dá)的情況及其意義。方法 免疫組化S-P法和Western blot方法檢測(cè)乳腺癌以及良性乳腺疾病組織中RhoA蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果 ①RhoA蛋白在乳腺癌組織中的陽性表達(dá)明顯優(yōu)于乳腺良性疾病組織中的表達(dá), 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 ②病理組織學(xué)分級(jí)(SBR分級(jí))、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的有無與RhoA蛋白在乳腺癌中表達(dá)有關(guān), 與患者年齡、腫瘤大小和臨床分期無關(guān)。結(jié)論 RhoGTPase家族成員RhoA蛋白在乳腺癌中的高表達(dá)說明其與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展的臨床效果關(guān)系密切。為深入研究和使用RhoA抑制劑抑制乳腺腫瘤發(fā)生和發(fā)展的臨床過程提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

RhoGTPase；RhoA；乳腺癌

惡性腫瘤的重要特征是侵襲和轉(zhuǎn)移, 這些特征也是患者死亡的主要原因。隨著對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移基因調(diào)控的多階段、多因素、多步驟理論的研究不斷跟進(jìn), 對(duì)于這一復(fù)雜病理過程有了更深入的認(rèn)識(shí)。在人體腫瘤中, RhoA蛋白的異常表達(dá)使腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)并促進(jìn)其遷徙, 因此與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［1］。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2014年1月～2014年6月期間在本院接受手術(shù)的女性患者120例。其中完整的乳腺癌蠟塊標(biāo)本60例、良性乳腺疾病標(biāo)本蠟塊20例, 手術(shù)切除的乳腺癌新鮮組織標(biāo)本20例、良性乳腺疾病新鮮組織標(biāo)本20例, 存放于-80℃冰箱凍存。年齡26～79歲, 平均年齡49歲。所有患者術(shù)前均未做放療、化療和內(nèi)分泌治療。乳腺癌標(biāo)本均經(jīng)病理證實(shí)為浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)檢測(cè)采用免疫組織化學(xué)SP法。RhoA多克隆抗體購于Santa Cruz公司、ALP標(biāo)記的山羊抗兔、山羊抗小鼠第二抗體、S-P試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑盒均購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。嚴(yán)格按照說明書操作(一抗稀釋度：RhoA 1：100)。

1.2.2 Western Blot 檢測(cè)手術(shù)切除的組織塊加入裂解液裂解后離心取上清。向樣品中加入500 μl RIPA緩沖液(1%NP-40, 5%脫氧膽酸鈉, 5%SDS, 0.1%PMSF),離心取上清?？捡R斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度, 準(zhǔn)確吸取50 μg蛋白質(zhì), 100 V電泳至溴酚藍(lán)出膠。將凝膠貼于PVDF膜上, 25 V轉(zhuǎn)印30 min, 5%脫脂奶粉封閉液中搖床過夜, 加入1：1000稀釋的一抗搖床上雜交2 h, 加入1：5000稀釋的二抗搖床雜交, 漂洗后顯色。應(yīng)用Chemi-Genius凝膠分析系統(tǒng)分析條帶灰度值。

1.3 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn) 由病理科醫(yī)師協(xié)助免疫組化結(jié)果判定。RhoA蛋白的表達(dá)呈彌漫性棕黃或棕褐色顆粒多呈現(xiàn)在乳腺癌的細(xì)胞質(zhì)。大多數(shù)良性乳腺疾病的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)未見或少見這種著色。癌細(xì)胞的每張切片先在低倍鏡下觀察, 這樣可確定癌組織部位, 然后再在高倍鏡下觀察, 每張切片隨機(jī)的選擇10個(gè)高倍視野, 輸入細(xì)胞圖像分析系統(tǒng), 記錄陽性細(xì)胞的個(gè)數(shù), 并計(jì)算陽性細(xì)胞百分率。RhoA蛋白陽性細(xì)胞可見細(xì)胞質(zhì)顯示棕黃或棕褐色, 判定標(biāo)準(zhǔn)是以陽性細(xì)胞數(shù)＜10%定為陰性(-), 陽性細(xì)胞數(shù)≥10%定為陽性(+)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)分析使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示, 采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率(%)表示, 采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Western Blot檢測(cè)RhoA蛋白在乳腺組織中的表達(dá) RhoA蛋白在20例良性乳腺疾病組織中呈低表達(dá), 灰度值為(36625.34±562.20),在20例乳腺癌組織中呈高表達(dá), 灰度值為(59634.78±184.44)。RhoA蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)值顯著高于良性乳腺疾病組織, 且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 免疫組化法測(cè)定RhoA蛋白在乳腺癌組織和良性乳腺疾病組織中的表達(dá)情況 RhoA在良性乳腺疾病組織中呈低表達(dá)(41%), 乳腺癌中呈高表達(dá)(76%)。RhoA蛋白在乳腺癌組織中表達(dá)的陽性率顯著高于良性乳腺疾病組織, 差異明顯,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

3 討論

腫瘤轉(zhuǎn)移高度相關(guān)的基因的發(fā)現(xiàn)及證實(shí), 已經(jīng)成為當(dāng)前腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制研究的熱點(diǎn), 原因是這些基因及其產(chǎn)物是一種重要的研究癌細(xì)胞的指標(biāo), 對(duì)治療癌癥患者具有重要意義。Rho家族蛋白是Ras超家族中最早被發(fā)現(xiàn)的一種能克隆的一種蛋白, 它們的相對(duì)分子質(zhì)量大約為20～25 kD, 并與三磷酸鳥苷(guanosine triphosphate, GTP)結(jié)合而成的蛋白, 具有GTP酶活性, 也可稱為Rho GTP酶。RhoA是Rho亞家族的成員, 主要參與張力纖維形成和粘著斑復(fù)合體(focal adhesion complexs, FACs)組裝［2］。

Rho GTP酶的工作原理和Ras超家族的其他成員一樣,就是羧基端通常具有共同結(jié)構(gòu)域。Rho GTP酶經(jīng)翻譯后修飾,這樣的Rho GTP酶才具有活性, 才可能與細(xì)胞膜上適宜的脂質(zhì)分子結(jié)合, 發(fā)揮其作用。Rho GTP酶是細(xì)胞內(nèi)信息傳播的介質(zhì), 在細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮橋梁作用。如在RhoA/ ROCK-2細(xì)胞通路中, 在血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF-C的參與下, 可促進(jìn)宮頸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移［3］。Rho GTP酶還可調(diào)節(jié)正常細(xì)胞的增殖、分化、凋亡, 并關(guān)系到腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。通過實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn), Rho GTP酶的異常表達(dá)可在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn), 細(xì)胞內(nèi)Rho GTP酶的表達(dá)的改變直接影響到腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移?；罨腞hoA可促進(jìn)骨肉瘤的轉(zhuǎn)移［4］。Rho GTP酶中尤其是RhoA是關(guān)鍵的調(diào)控因子, 主要參與對(duì)細(xì)胞形態(tài)改變, 細(xì)胞與基質(zhì)粘附及細(xì)胞骨架重組的調(diào)控, 調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移過程［5］。GTPases的羧基甲基化和等離子體膜易位可以通過葉酸進(jìn)行調(diào)節(jié), 研究表明缺乏葉酸會(huì)導(dǎo)致這些蛋白質(zhì)保留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng), 減少肺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。非活化(GDP-bound) GTPases向活化的(GTP-bound)GTPases導(dǎo)致下游激酶的活化, PAK、 LIMK和肌動(dòng)蛋白的磷酸化過程中葉酸起到一定的作用, 其作用通過 RhoA 和Rac1進(jìn)行,但不是Cdc42。通過針對(duì)RhoA或Rac1做為靶點(diǎn)可阻斷葉酸對(duì)磷酸化和細(xì)胞遷移和入侵的影響, 進(jìn)一步控制惡性腫瘤的發(fā)展。

RhoA參與癌癥發(fā)生、發(fā)展的重要環(huán)節(jié), 是關(guān)鍵的調(diào)控因子, RhoA可以成為腫瘤藥物開發(fā)的新靶位, 并且針對(duì)RhoA進(jìn)行的腫瘤治療很有可能減少傳統(tǒng)抗癌藥物的副作用,對(duì)于腫瘤的臨床治療將具有良好的應(yīng)用前景。

［1］ Senoo H, Iijima M.Rho GTPase: A molecular compass for directional cell migration.Senoo H, Iijima M.Commun Integr Biol, 2013, 6(6):27681.

［2］ Makrodouli E, Oikonomou E, Koc M, et al.BRAF and RAS oncogenes regulate Rho GTPase pathways to mediate migration and invasion properties in human colon cancer cells: a comparative study.Mol Cancer, 2011, 23(10):118.

［3］ He M, Cheng Y, Li W, et al.Vascular endothelial growth factor C promotes cervical cancer metastasis via up-regulation and activation of RhoA/ROCK-2/moesin cascade.BMC Cancer, 2010, 29(10):170.

［4］ Chiappetta C, Leopizzi M, Censi F, et al.Correlation of the Racl/ RhoA Pathway With Ezrin Expression in Osteosarcoma.Appl Immunohistochem Mol Morphol, 2014, 22(3):162-170.

［5］ Li H, Peyrollier K, Kilic G, et al.Rho GTPases and cancer.Biofactors, 2014, 40(2):226-235.

10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.03.031

2014-10-10］

117000 遼寧本溪本鋼總醫(yī)院乳腺外科