徐家淳，程素利，王劍歌，焦召華，王 凱，蔡志敏，李 巖△，周 震，陸 軍，劉保紅，周智梁

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津300193;2.天津市公安醫(yī)院，天津300042; 3.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，天津300150)

實驗研究

火針對急性脊髓損傷24 h后ERK通路基因的影響*

徐家淳1，程素利1，王劍歌1，焦召華2，王 凱3，蔡志敏1，李 巖2△，周 震3，陸 軍2，劉保紅2，周智梁3

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津300193;2.天津市公安醫(yī)院，天津300042; 3.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，天津300150)

目的:觀察火針對急性脊髓損傷24 h后ERK通路上相關(guān)基因的調(diào)控作用。方法:將40只SD雌性大鼠隨機分為空白組、假手術(shù)組、模型組及火針治療組，采用改良的Allen’s法對模型組和火針組造模，造模前后進行Basso Beattie Bresnahan(BBB)功能評分。造模24 h后取各組大鼠損傷段脊髓，通過RT－PCR技術(shù)檢測ERK通路上基因表達。結(jié)果:模型組和火針組造模后BBB評分皆為0.00± 0.00，造模成功。RT－PCR檢測顯示脊髓損傷24 h后模型組ERK通路Ras、ERK1和ERK2基因表達較空白組和假手術(shù)組明顯增多(P＜0.05)，且火針組ERK通路基因表達較模型組明顯減少(P＜0.05)。結(jié)論:ERK通路參與脊髓損傷，且火針可抑制急性脊髓損傷24 h后ERK通路上相關(guān)基因的表達。

火針;脊髓損傷;ERK通路;增殖;基因

脊髓損傷(Spinal cord injury，SCI)是一種神經(jīng)細胞軸突破壞所致的嚴重神經(jīng)損傷疾病，可導(dǎo)致?lián)p傷節(jié)段以下肢體的功能障礙，分為原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷。前者由外力產(chǎn)生，損傷不可逆;后者由原發(fā)性損傷啟動的一系列復(fù)雜過程造成脊髓損害進一步加重，其損害有時甚至超過原發(fā)性損傷，發(fā)病率較高，目前缺乏良好的治療措施，嚴重影響患者生活質(zhì)量［1］。

脊髓損傷后的神經(jīng)修復(fù)治療近年來主要圍繞在神經(jīng)干細胞的增殖與分化方面［2］，神經(jīng)干細胞的增殖分化受細胞內(nèi)外信號的調(diào)節(jié)。絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinase，MAPK)是哺乳動物體內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，參與調(diào)控生物體內(nèi)多種細胞應(yīng)答和生理、病理過程［3］，包括細胞的生長、增殖和分化。

細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(Extracellular signal－regulated kinase，ERK)是MAPK家族的一個重要亞族，包括ERK1和ERK2，統(tǒng)稱為ERK1/2。研究表明，ERK信號通路活化與大鼠脊髓損傷所致的脊髓神經(jīng)退行性變和功能障礙相關(guān)［4］，且ERK1/2抑制劑可明顯減輕脊髓繼發(fā)性損傷，改善大鼠的神經(jīng)功能［5］。本課題組通過火針干預(yù)急性脊髓損傷大鼠，觀察火針對脊髓損傷24 h后ERK通路的調(diào)控作用，為火針臨床治療急性脊髓損傷提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

雌性SD大鼠40只(2月齡)，體重260 g左右，由中國食品藥品檢定研究所提供，許可證號:SCXK(京) 2009－0017。

1.2 儀器

PCR擴增儀(德國Eppendorf公司)，熒光定量PCR儀Rotor Gene 6000(美國Corbett公司)，高速離心機(德國Eppendorf公司)，冷凍高速離心機(德國Eppendorf公司)，BioPhotometer plus(德國Eppendorf公司)，超低溫冰箱(日本SANYO公司)，取液器(德國Eppendorf公司)

1.3 分組

將大鼠隨機分為空白組、假手術(shù)組、脊髓損傷對照組(模型組)和火針治療組(火針組)，每組各10只大鼠。

1.4 動物模型制備

采用本課題組改良的Allen＇s法［6］對模型組和火針組大鼠建立急性脊髓損傷模型。

1.5 行為學(xué)評分

造模前后對各組大鼠雙側(cè)后肢進行Basso Beattie Bresnahan行為功能評分(BBB運動評分)［7］。

1.6 火針干預(yù)

評分后對火針治療組脊髓損傷大鼠進行火針針刺1次。

1.6.1 選穴 參照中國針灸學(xué)會實驗針灸分會制定的《動物針灸穴位圖譜》及《實驗針灸學(xué)》。在手術(shù)部位選取穴位:T7、T8及T11、T12棘突間隙旁的華佗夾脊穴。

1.6.2 操作方法 左手持酒精燈盡量接近針刺的部位;右手持針柄置火針于酒精燈外焰處加熱針體至通紅，施針于患處，每穴1針，進針約3～5 mm迅速出針，整個過程僅需要1/3 s。

1.7 取材與指標檢測

各組大鼠在24 h后取材。

1.7.1 檢測指標 ERK信號通路中Ras、ERK1和ERK2基因表達。

1.7.2 檢測方法 提取總RNA:按照Trizol試劑盒(Gibco公司)說明提取總RNA，加DEPC水20 ul溶解。紫外分光光度計測量吸光度(A)值，A260/A280大于1.8，然后將在0.1 g瓊脂糖凝膠電泳上顯示，證實含有18 s和28 s兩條帶的標本用于反轉(zhuǎn)錄步驟。

反轉(zhuǎn)錄:校正每組總RNA濃度為1 ug/1 ul，每2 ugRNA加入Oligod(T)181 ul，72℃變性10 min，取出后立即臵于冰上2 min。后加入DEPC水11.5 ul+ 5Xbuffer2.5ul+dNTPMixture0.5ul+RNase0.5ul+MMLV0.5ul，在室溫下靜置10 min。42℃水浴1 h，冰上放置2 min。

熒光定量PCR:采用25 ul反應(yīng)體系:分別加入MasterMix 12.5 μl、5μMForwardPrimer0.25 μl、5μMReversePrimer 0.25 μl、Template 2.5 μl和DeionizedWater 9.5 μl混勻(ForwardPrimer與ReversePrimer分別為IRE－1、PERK、ATF6、GADD153/CHOP、JNK、Caspase－12引物序列)。放入熒光定量PCR儀中，條件為95℃、10 min后;執(zhí)行95℃、15 s，60℃、1 min，40cycles，以觀察熒光定量熔解度。

1.8 統(tǒng)計方法

采用SPSS13.0軟件進行檢驗，BBB評分數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，各組RT－PCRΔCT值用單因素方差分析比較組間差異，表達水平比率以2－ΔΔCT表示，P＜0.05表示差異具有顯著性意義。

2 結(jié)果

各組大鼠造模前后BBB運動評分見表1。模型組及火針組大鼠造模后評分為0.00±0.00，造模成功。

表1 各組大鼠14天內(nèi)BBB評分情況比較 (±s)

表1 各組大鼠14天內(nèi)BBB評分情況比較 (±s)

組別 n 造模前 造模后空白組10 21.00±0.00 21.00±0.00假手術(shù)組 10 21.00±0.00 21.00±0.00模型組 10 21.00±0.00 0.00±0.00火針組10 21.00±0.00 0.00±0.00

RT－PCR檢測結(jié)果顯示脊髓損傷24 h后模型組ERK通路關(guān)鍵基因Ras、ERK1、ERK2表達量較空白組和假手術(shù)組明顯增多(P＜0.05)，且火針組ERK通路基因表達較模型組明顯減少(P＜0.05)。見表2。

3 討論

脊髓損傷(SCI)是以神經(jīng)細胞軸突遭到破壞為主，表現(xiàn)為肢體運動癱瘓和感覺喪失的一種疾病，給患者和家屬帶來嚴重的身心傷害。神經(jīng)干細胞的增殖和分化是近年來對脊髓損傷治療的熱點，是神經(jīng)再生修復(fù)的關(guān)鍵。

神經(jīng)干細胞增殖和分化受多種信號的調(diào)節(jié)，MAPK通路是一條重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，能夠?qū)⒉煌陌庑盘杺鲗?dǎo)至細胞核，引起細胞生長、增殖和分化。作為MAPK的重要成員，ERK是膜受體信號向細胞內(nèi)傳遞的重要途徑，參與細胞生長發(fā)育和增殖分化等。信號傳遞步驟遵循MAPK的三級酶促級聯(lián)反應(yīng): Ras作為上游激活蛋白，Raf作為MAPK，MAPK/ERK激酶(Mek)作為MAPK，ERK即MAPK。國內(nèi)外研究皆發(fā)現(xiàn)，ERK信號通路活化與大鼠脊髓損傷所致的脊髓神經(jīng)退行性變和功能障礙相關(guān)［4］，而針灸已被證實可抑制ERK通路，減輕脊髓損傷引起的疼痛［8］。

近年來臨床發(fā)現(xiàn)針灸對脊髓損傷所引起的疼痛［9］及其他并發(fā)癥具有很大的改善作用，實驗研究也發(fā)現(xiàn)了針灸對脊髓損傷的抗炎機制［10］，且可促進神經(jīng)細胞增殖［11］，并通過ERK通路促進腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain derived neurotrophic factor，BDNF)的表達［12］?；疳槸煼閭鹘y(tǒng)針灸療法的一種，針具較一般針灸針稍粗，主要通過將燒紅的針體刺入穴位達到治療疾病的目的。相較于普通毫針，火針刺激量大，且同時具有溫?zé)岬男Ч?，對痹癥、痤瘡、婦科疾患都具有很好的療效。研究表明火針可促進脊髓損傷大鼠神經(jīng)干細胞增殖［13］，減少大鼠白介素1β(IL－1β)、胱氨酸蛋白酶(Caspase－3)表達［14］。

本次研究發(fā)現(xiàn)，急性脊髓損傷24 h后，模型組大鼠Ras、ERK1/2表達量較空白組和假手術(shù)組明顯增多，表明脊髓損傷后ERK通路被激活，ERK通路參與脊髓損傷;火針治療24 h后Ras、ERK1/2表達量較模型組都有所減少，表明火針可抑制急性脊髓損傷24 h后ERK通路相關(guān)基因表達。筆者推測火針可能通過下調(diào)脊髓組織中ERK通路相關(guān)基因表達，促進神經(jīng)干細胞增殖分化，修復(fù)脊髓神經(jīng)損傷。本課題組在此僅明確了火針對急性脊髓損傷24 h后ERK通路的調(diào)控作用，但無法確定其長期效果，因此需要在后續(xù)的實驗中加大樣本量，設(shè)立多個時相以觀察火針對脊髓損傷后ERK通路的遠期調(diào)控作用，同時觀察火針對脊髓損傷后肢體功能障礙的改善，為火針應(yīng)用于臨床建立實驗基礎(chǔ)。

［1］Williams R，Murray A.Prevalence of depression after spinal cord injury:a meta－analysis［J］.Arch Phys Med Rehabil，2015，96(1): 133－140

［2］Lee－Kubli CA，Lu P.Induced pluripotent stem cell－derived neural stem cell therapies for spinal cord injury［J］.Neural Regen Res，2015，10(1):10－16

［3］Nicaise C，Mitrecic D，F(xiàn)alnikar A，et al.Transplantation of stem cellderived astrocytes for the treatment of amyotrophic lateral sclerosis and spinal cord injury［J］.World J Stem Cells，2015，7(2):380－398

［4］Yu CG，Yezierski RP，Joshi A，et al.Involvement of ERK2 in traumatic spinal cord injury［J］.Journal of Neurochemistry，2010，113(1): 131－142

［5］Genovese T，Esposito E，Mazzon E，et al.Evidence for the role of mitogen－activated protein kinase signaling pathways in the development of spinal cord injury［J］.J Pharmacol Exp Ther，2008，325(1):100－114

［6］孫立明，李巖，周震，等.火針對脊髓損傷模型大鼠凋亡相關(guān)蛋白表達的影響［J］.針灸臨床雜志，2010，26(12):49－53

［7］Scheff SW，Saucier DA，Cain ME.A statistical method for analyzing rating scale data:the BBB locomotor score［J］.J neurotrauma，2002，19(10):1251－1260

［8］Choi DC，Lee JY，Lim EJ，et al.Inhibition of ROS－induced p38MAPK and ERK activation in microglia by acupuncture relieves neuropathic pain after spinal cord injury in rats［J］.Experimental Neurology，2012，236(2):268－282

［9］Wang Y，Li Y.Acupuncture for 58 cases of central pain after spinal cord injury［J］.Zhongguo Zhen Jiu，2014，34(1):88

［10］Lee JY，Choi DC，Oh TH，et al.Analgesic effect of acupuncture is mediated via inhibition of JNK activation in astrocytes after spinal cord injury［J］.PLoS One，2013，8(9):e73948

［11］Yan Q，Ruan JW，Ding Y，et al.Electro－acupuncture promotes differentiation of mesenchymal stem cells，regeneration of nerve fibers and partial functional recovery after spinal cord injury［J］.Exp Toxicol Pathol，2011，63(1－2):151－156

［12］Wenjin W，Wenchao L，Hao Z，et al.Electrical Stimulation Promotes BDNF Expression in Spinal Cord Neurons Through Ca2+and Erk－Dependent Signaling Pathways［J］.Cellular and Molecular Neurobiology，2011，31(3):459－467

［13］李巖，周震，程素利，等.火針干預(yù)脊髓損傷大鼠后血清對神經(jīng)干細胞增殖分化的影響［J］.天津中醫(yī)藥，2013，30(1):25－27

［14］周震，李巖，倪虹，等.火針對脊髓損傷模型大鼠IL－1β、Caspase－3蛋白表達的影響［J］.上海針灸雜志，2010，29(5):318－321

Influence of Fire Needle on Genes in ERK Signal Pathway 24 h after Acute Spinal Cord Injury

XU Jia－chun1，CHENG Su－li1，WANG Jian－ge1，JIAO Zhao－h(huán)ua2，WANG Kai3，CAI Zhi－min1，LI Yan2△，ZHOU Zhen3，LU Jun2，LIU Bao－h(huán)ong2，ZHOU Zhi－liang3
(1.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin300193，China; 2.Tianjin Police Hospital，Tianjin300042，China;3.Second Affiliated Hospital of Tianjin University of TCM，Tianjin300150，China)

Objective:To explore the influence of fire needle on genes in ERK signal pathway 24 h after acute spinal cord injury(SCI).Methods:Forty SD female rats were randomized into a blank group，a sham operation group，a model group and a fire needle treatment group.Modified Allen’s method was applied to build acute SCI models，and Basso，Beattie and Bresnahan Scale Locomotor Assessment(BBB assessment)were used to assess the limb movement before and after modeling.Twenty－24 hours after modeling，Reverse Transcription－Polymerase Chain Reaction(RT－PCR)was performed to detect the expression of genes in ERK signal pathway.Results:BBB scores of rats in model and fire needle treatment groups were 0.00±0.00.Results of RTPCR showed a significant increase of Ras and ERK 1 and ERK2 in the model group compared with the blank and sham operation groups(P＜0.05)，and the expression in fire needle group was significantly less than that in the model group.Conclusion:ERK signal pathway is involved in SCI，and the fire needle could inhibit the expression of genes in ERK signal pathway.

Fire needle;SCI;ERK;Proliferation;Gene

R246.6

A

1005－0779(2015)010－0068－03

國家自然科學(xué)基金面上項目，編號:81373839;天津市應(yīng)用基礎(chǔ)及前沿技術(shù)研究計劃重點項目，編號:13JCZDJC31800。

徐家淳(1989－)，男，2015級中醫(yī)內(nèi)科學(xué)專業(yè)博士研究生。

△通訊作者:李巖(1970－)，男，主任醫(yī)師，研究方向:火針、刺絡(luò)臨床及實驗研究。

2015－04－13