朱路文，唐 強，李 季，趙 彬，陳慧杰

(黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱150001)

缺血性卒中(ischemic stroke)約占全部腦卒中的70%，其發(fā)病率、致殘率和致死率高。腦缺血后常伴有運動障礙、感覺障礙、認知功能障礙等，嚴重影響了患者的日常生活。針康法是腦卒中康復的新策略，是頭穴叢刺與現代康復技術的有機結合，具有針刺康復同步、動態(tài)治療的特點［1］。前期研究表明，針康法能減輕缺血腦組織水腫，增加缺血周邊區(qū)突觸數目，升高腦缺血區(qū)皮層GAP-43 表達，降低Nogo-A 表達［2］。血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)是一種促血管新生因子，對局灶性腦缺血神經功能缺損改善作用明顯。層粘連蛋白(Laminin，LN)變化可直接導致血腦屏障通透性的改變［3］，在腦缺血中有維持血管完整性、防止腦水腫及繼發(fā)性神經元損傷的作用［4］。本研究觀察腦缺血后及針康法干預后腦組織VEGF 及LN 的變化，探討針康法治療缺血性腦卒中的相關作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

清潔級Sprague- Dawley(SD)雄性大鼠，體重(250 ±30)g，購自黑龍江中醫(yī)藥大學動物實驗中心，動物質量合格證編號為SYXK(黑)2010007。飼養(yǎng)條件:SPF 級實驗中心，大鼠可自由進食、飲水，室溫控制在20℃～25℃，濕度保持50% ～60%，明暗光照12 h晝夜循環(huán)。

隨機將90 只大鼠分成模型組、假手術組、針刺組、康復組及針康組5 組，每組按術后3 天、7 天、14 天時間點再分為3 個亞組，每個亞組6 只。實驗處置符合小動物倫理標準。

1.2 主要儀器及試劑

RM2265 型切片(德國Leica);HI1210 型攤片機(德國Leica);DHG-9030A 型電熱鼓風干燥箱(中國上海);兔抗大鼠VEGF 多克隆抗體(武漢博士德);兔抗大鼠LN 多克隆抗體(武漢博士德)。

1.3 模型制備

采用阻閉大鼠大腦中動脈(Middle cerebral artery occlusion，MCAO)誘導永久性局灶性腦缺血。術前12 h禁食不禁水。10%水合氯醛麻醉，術中動物保持自主呼吸，恒溫加熱板保持大鼠體溫恒定(37. 0 ±0.5℃)。頸部常規(guī)消毒，頸部正中切口，暴露大鼠頸總動脈、頸外動脈以及頸內動脈，將頸總及頸外動脈結扎，在頸總動脈分叉部的下方使用眼科剪剪一小切口，將尼龍單纖絲線(Japan)一末端烤成約2.6 cm 的圓頭插入頸內動脈17 ～18 mm，完全阻斷大腦中動脈的血流。假手術組大鼠手術方法同模型組，但線栓僅從頸總動脈插入約10 mm，不能阻斷大腦中動脈血流供應。術后6 h 采用改良的Bederson 標準［5］進行神經功能評分，1 ～3 分的pMCAO 大鼠納入本實驗。

1.4 干預方法

模型組:造模后回籠飼養(yǎng)，不予任何治療，只予以同等條件抓取。

假手術組:造模后回籠飼養(yǎng)，不予任何治療，只予以同等條件抓取。

針刺組:造模后24 h，采用頭穴叢刺針法治療。參照前期實驗研究，采用1.0 寸針灸針，取百會穴及百會左、右側各旁開2 mm 處針刺，快速捻轉1 min 后留針2 h，每日1 次。

康復組:造模后24 h，采用跑臺訓練模擬臨床康復治療(在造模前均經過適應性跑臺訓練3 天，每天10 min，速度為15 m/min)。參照前期預實驗形成的方案:時間:30 min/天;速度:1 ～3 天8 m/min，4 ～7 天12 m/min，7 天后15 m/min;坡度:0°;1 次/天。

針康組:造模后24 h，采用針康法治療。針康法參照［6］，頭穴叢刺留針期間進行跑臺訓練，針刺方案同針刺組、跑臺方案同康復組，每日1 次。

1.5 取材及指標檢測方法

術后3 天、7 天、14 天，大鼠以10%水合氯醛麻醉，0.9%生理鹽水200 ml、4%多聚甲醛200 ml 灌注。分離缺血側腦組織，4%多聚甲醛PBS 溶液中固定48 h后，取視交叉和其后4 mm 處兩點，切取腦冠狀薄片，厚度約4 mm，常規(guī)石蠟包埋，切片厚度為4 ～6 μm，免疫組織化學染色。

采用免疫組化PV 二步法檢測血管內皮生長因子(VEGF)、層粘連蛋白(LN)在缺血半暗區(qū)皮層的表達，具體方法參照試劑盒。每只大鼠取相同部位連續(xù)切片5 張，顯微鏡在10 ×40 倍下對視野中VEGF、LN陽性細胞進行計數，取平均值進行統(tǒng)計分析。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 各組大鼠缺血半暗區(qū)皮層血管內皮生長因子(VEGF)的表達

假手術組可見少量的血管內皮生長因子(VEGF)表達，陽性細胞胞體小，突起細。腦缺血后，VEGF 陽性表達增多，隨著缺血時間延長，先增加后降低，與假手術組比較差異顯著(P ＜0.05)。采用針康法、針刺、康復訓練干預后，缺血腦組織VEGF 陽性細胞數增加，說明針刺、康復訓練、針康法均能促進腦缺血后血管內皮細胞增殖。術后7 天、14 天，與模型組相比，康復組、針刺組與針康組VEGF 陽性表達增強(P ＜0.05);與康復組、針刺組比較，針康組VEGF 陽性細胞數增多(P ＜0.05)。以上結果表明，針康法能啟動腦缺血后內源機制，促進VEGF 陽性表達，優(yōu)于單純康復和針刺。見圖1。

圖1 VEGF 陽性細胞統(tǒng)計圖

2.2 各組大鼠缺血半暗區(qū)皮層層粘連蛋白(LN)的表達

假手術組LN 陽性表達較強，鏡下可見大量LN 陽性細胞，呈裂隙狀或條索狀。模型組LN 陽性表達較低，與假手術組比較，差異顯著(P ＜0.05)，表明腦缺血后血腦屏障受損，LN 的表達下降。隨著缺血時間延長，LN 的表達逐漸增加。術后7 天、14 天，康復組、針刺組與針康組LN 陽性表達較模型組增強(P ＜0.05);與康復組、針刺組比較，針康組LN 陽性細胞數明顯增多(P ＜0.05)。以上結果表明，針刺、康復訓練、針康法干預均能促進LN 陽性表達，改善血腦屏障的通透性，針康法的治療優(yōu)勢更明顯。見圖2。

圖2 LN 陽性細胞統(tǒng)計圖

3 討論

針康法是頭穴叢刺與現代康復技術的有機結合，具有“針康同步、動態(tài)治療、整體康復”的特點。在針康法的核心內容中，頭穴叢刺的效應能夠透過顱骨，刺激大腦皮層，直達責任病灶;康復訓練作用于四肢，通過多次重復的動作，非侵入性刺激中樞系統(tǒng)，提高腦結構、功能的可塑性，兩者雙向調節(jié)、同時作用，促進受損腦功能的恢復。

VEGF 又名血管通透性因子，是一種特異性地作用于內皮細胞表面受體的血管生成因子，具有維持血管通透性、誘導血管發(fā)生的作用。腦缺血、缺氧可誘導內源性VEGF 表達，促進血管內皮細胞分化、增殖，縮小腦梗死體積;血管表皮生長因子受體(VEGF-R)通過多種信號途徑介導微血管及神經再生，促進內源性神經干細胞增殖、遷移和分化，發(fā)揮腦保護作用［7］。本實驗中，各時間點模型組VEGF 陽性細胞數較假手術組增加，差異顯著(P ＜0.05)，說明腦缺血啟動內源性機制促進VEGF 陽性表達，修復損傷的血管內皮細胞。各時間點，針刺組、康復組及針康組VEGF 陽性細胞表達均明顯高于模型組，說明3 種干預方法均能激活神經血管單元中的血管內皮保護因子;陳鵬典等［8］證明了督脈電針聯(lián)合人臍血MSCs 移植具有協(xié)同效應，可上調缺血區(qū)半暗帶VEGF 表達，促進血管新生，與本研究結果相一致。術后7 天、14 天兩個時間點，針康組VEGF 陽性表達明顯高于針刺組及康復組(P ＜0.05)，這表明針康法可上調VEGF 陽性表達，在促進腦缺血后微血管修復上優(yōu)于單純針刺及康復。

血腦屏障是腦組織最重要的防御結構之一，其通透性發(fā)生改變將影響神經元的存活。LN 是一種大型的糖蛋白，是胚胎發(fā)育中出現最早的細胞外基質成分［3］，與Ⅳ型膠原一起構成基膜，參與組成血腦屏障，缺血后它的一系列變化將直接改變血腦屏障通透性。細胞表面的特異性受體與層粘連蛋白結合，細胞與基底膜結合成為一個緊密體，起到保護、過濾的作用，并決定細胞的極性，影響細胞的代謝、存活、遷移、增殖和分化［4］。本研究結果發(fā)現，腦缺血后LN 蛋白的表達增加，恢復血腦屏障通透性，同時與神經膠質細胞共同促進神經元的生長、分化以及軸突的生長。針康法、針刺、康復干預后LN 的表達較模型組明顯上調，說明這3 種方法都能通過恢復血腦屏障通透性發(fā)揮腦保護作用，但針康法上調LN 的表達更加明顯，在保護血腦屏障上的優(yōu)勢更突出。

綜上，本實驗結果表明針康法能促進腦缺血區(qū)半暗區(qū)VEGF、LN 的表達，從而促進腦缺血后微血管的再生，改善血腦屏障的通透性。

［1］ 唐強.頭穴叢刺與康復治療的有機結合［J］. 中國康復理論與實踐，2011，17(4):301-303

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［3］ 胡曉松，周東，唐瑜，等. 層粘連蛋白及基質金屬蛋白酶-9 在大鼠局灶性腦缺血梗死區(qū)周圍的表達及意義［J］. 華西醫(yī)學，2013，28(5):651-654

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［5］ BEDERSON JB，PITTS LH，TSUJI M，et al.Rat middle cerebral artery occlusion:evaluation of the model and development of a neurologic examination［J］.Stroke，1986，17(3):472-6

［6］ 唐強，劉宏光，王艷，等.針康法對局灶性腦缺血大鼠前肢運動功能及缺血區(qū)突觸素和生長相關蛋白-43 表達的影響［J］.中國康復理論與實踐，2011，17(10):973-6

［7］ 姚瑞芹，李林.血管內皮細胞生長因子在缺血性腦損傷中血管新生，神經發(fā)生和神經保護的作用［J］.中國康復理論與實踐，2007，13(3):208-11

［8］ 陳鵬典，楊卓欣，于海波，等. 督脈電針聯(lián)合人臍血MSCs 移植對腦缺血大鼠VEGF 蛋白表達的影響［J］.中華中醫(yī)藥學刊，2014，32(6):1261-3