祁田甜，張 嬋,,*，胡濟美，郎天丹，王成濤,,*，趙吉興

（1.北京工商大學 北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京 100048；2.北京工商大學 食品質(zhì)量與安全北京實驗室，北京 100048；3.中國國際工程咨詢公司，北京 100048；4.山東中惠食品有限公司，山東 濱州 251706）

紅曲類產(chǎn)品在我國的生產(chǎn)和使用已有1 000多年歷史，廣泛用于釀酒、食品著色、醫(yī)藥等方面[1]。紫色紅曲霉（Monascus purpureus Went.）屬于真菌門子囊菌綱真子囊菌亞綱紅曲霉屬，能夠產(chǎn)生多種對人體有益的次級代謝產(chǎn)物，如膽固醇合成抑制劑Monacolin K、紅曲色素、麥角固醇、γ-氨基丁酸等。1979年日本學者Endo[2]首次從紅色紅曲霉（Monascus ruber）的培養(yǎng)液中分離出能有效抑制膽固醇合成關鍵酶——羥甲基戊二酸單酰輔酶A（3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A，HMG-CoA）還原酶的化合物Monacolin K。Monacolin K（又稱洛伐他汀，lovastatin）是一種曲霉菌屬合成的次級代謝產(chǎn)物，因其結(jié)構(gòu)與HMG-CoA的結(jié)構(gòu)相類似，可競爭性地抑制膽固醇合成途徑中HMG-CoA還原酶的活性，因此具有抑制人體膽固醇合成、降血脂的作用[3-4]，且具有高效、低毒、安全等特點[5]。

清華大學與北京思清源公司合作研發(fā)出新型常壓室溫等離子體（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）誘變系統(tǒng)，通過發(fā)射均勻且粒子豐富的等離子體射流，使活性粒子透過細胞膜作用于DNA物質(zhì)，引起DNA的多樣性損傷，細胞中的DNA不完全修復形成遺傳穩(wěn)定的突變株。ARTP具有射流溫度低（25～35℃）、活性粒子分布均勻、對人體和環(huán)境無危害的特點，與真空條件下運作的常規(guī)低壓離子束植入操作系統(tǒng)相比，由于除去了復雜和昂貴的真空系統(tǒng)，常壓室溫等離子技術(shù)可以在一個非常小的環(huán)境內(nèi)以惰性氣體為基礎的等離子體射流區(qū)域中進行，并且可以提高操作的安全性，同時控制不同的劑量[6-7]。研究結(jié)果表明，ARTP誘變使黑曲霉產(chǎn)脂肪酶的比活力比出發(fā)菌株提高約37%，獲得產(chǎn)油酵母突變株表現(xiàn)出比野生型更高的生長速率和更高的油脂產(chǎn)量，且正突變率超過30%，構(gòu)建高產(chǎn)琥珀酸的大腸桿菌工程菌產(chǎn)量達到0.87 g/g[8-10]。由于其獨特的功能和潛在的應用價值，ARTP誘變系統(tǒng)被應用于許多領域，如生物、化學凈化劑和熱敏感性醫(yī)療儀器消毒方面[11]，已然成為生物誘變育種領域的一個研究熱點。本實驗將ARTP誘變技術(shù)應用于紅曲霉菌株育種，期望能篩選得到一株高產(chǎn)Monacolin K的突變株，為Monacolin K及降膽固醇藥物的生產(chǎn)提供支持。

1 材料與方法

1.1 菌種、培養(yǎng)基與試劑

紫色紅曲霉Monascus purpureus M-1，由本實驗室篩選、保存。

斜面培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、酵母提取物4 g/L、蛋白胨3 g/L、麥芽浸粉20 g/L、KH2PO42 g/L、瓊脂15 g/L，自然pH值。

平板活化培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、酵母提取物4 g/L、蛋白胨3 g/L、麥芽浸粉20 g/L、KH2PO42 g/L、瓊脂15 g/L，自然pH值。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖30 g/L、黃豆粉15 g/L、MgSO41 g/L、甘油70 mL/L、蛋白胨10 g/L、NaNO32 g/L、KH2PO42 g/L，自然pH值。

發(fā)酵培養(yǎng)基：甘油90 mL/L、大米粉水解液20 mL/L、蛋白胨10 g/L、NaNO35 g/L、MgSO41 g/L、ZnSO42 g/L、KH2PO42.5 g/L，乳酸調(diào)pH 4.5。

Monacolin K標準品 美國Sigma公司；NaCl、NaH2PO4、Na2HPO4、NaNO3、KH2PO4、MgSO4、ZnSO4、25%戊二醛、醋酸異戊酯、乙醇、六甲基二硅胺（hexamethyldisilazane，HMDS） 國藥集團化學試劑有限公司；酵母提取物、蛋白胨、麥芽浸粉、甘油北京奧博星生物技術(shù)有限公司；甲醇（色譜純） 美國Fisher公司。

1.2 儀器與設備

LC-20AT高效液相色譜儀、WondaSilTMC18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm） 日本島津公司；VEGA 3LMU/LMH掃描電子顯微鏡 捷克Tescan公司；GT10-1高速離心機 上海安亭科學儀器廠；BPH-9082恒溫培養(yǎng)箱 德國Eppendorf New Brunswick公司；OBY-H160-SE1恒溫恒濕培養(yǎng)箱 常州歐邦電子有限公司；DL-CJ-1NDII 2NDI 2NDII超凈工作臺 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；DHG-9620B智能電熱恒溫鼓風干燥箱 上?，槴\實驗設備有限公司；DSX-280B立式壓力蒸汽滅菌器上海申安醫(yī)療器械廠；M-pact AX124分析天平 上海歡奧科技公司；常壓室溫等離子體誘變育種機 北京思清源生物科技有限公司；Eiko IB-3型離子濺射儀 日本EIKO公司。

1.3 方法

1.3.1 ARTP誘變處理[12]

將試管斜面30℃活化7 d的紫色紅曲霉菌體用無菌生理鹽水沖洗、過濾，孢子懸液濃度調(diào)節(jié)至106～107個/mL，添加甘油至體積分數(shù)為5%。將菌懸液均勻涂抹在金屬載片表面，用鑷子將菌物載片轉(zhuǎn)移到載物臺，設定參數(shù)在工作氣流量為10 L/min，等離子體發(fā)射源與樣品距離為2 mm，操作溫度23.0～35.0℃的條件下，分別照射0、30、60、75、90、120、150、180 s，處理后將載片轉(zhuǎn)移到裝有1 mL生理鹽水的EP管中，振蕩洗脫形成新的菌懸液，不同梯度稀釋后涂布平板，培養(yǎng)48 h后觀察菌落形態(tài)特征。采用平板活菌計數(shù)法（CFU法）來計算ARTP處理的致死率，獲得致死曲線。

1.3.2 突變菌株篩選

將ARTP誘變處理的菌懸液稀釋涂布平板，30℃恒溫培養(yǎng)3 d。選取單個菌落接入試管種子培養(yǎng)基，于30℃、200 r/min條件下培養(yǎng)48 h，接種后于30℃、150 r/min搖床培養(yǎng)13 d，取發(fā)酵液用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法檢測Monacolin K產(chǎn)量。

1.3.3 分析檢測方法

1.3.3.1 平板活菌計數(shù)法測定菌體濃度

誘變后菌懸液稀釋至10－1、10－2、10－33個梯度，每個梯度3～5個涂布平板，30℃培養(yǎng)2 d后計數(shù)，根據(jù)存活菌體數(shù)，按照公式（1）計算致死率[4]。

式中：U為未經(jīng)ARTP處理的平板菌落數(shù)/（CFU/μL）；T為ARTP處理后的平板菌落數(shù)/（CFU/μL）。

誘變菌株突變率計算：以Monacolin K的產(chǎn)量為標準，將產(chǎn)量降低或提高20%以上的誘變菌株定義為突變株[13]，按照公式（2）、（3）計算菌株突變率和正突變率。

1.3.3.2 Monacolin K產(chǎn)量及菌體生物量測定

標準品預處理：準確稱量Monacolin K標準品溶于75%甲醇配制成200 mg/L標準溶液，0.45 μm有機微孔濾膜過濾，進樣檢測。

發(fā)酵液預處理：取培養(yǎng)13 d的發(fā)酵液5 mL加入15 mL 75%甲醇，200 W超聲波輔助萃取30 min，靜置過夜，10 000 r/min離心，0.45 μm有機微孔濾膜過濾，取濾液用HPLC法檢測Monacolin K含量。

HPLC檢測條件[14-15]：WondaSilTMC18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.1%磷酸（3∶1，V/V），流速l mL/min，紫外檢測器檢測波長238 nm，柱溫箱30℃，進樣量10 μL。

[16]，采用菌絲體干質(zhì)量法測定發(fā)酵1～10 d的菌體生物量。

1.3.3.3 掃描電子顯微鏡檢測菌體形態(tài)

培養(yǎng)8 d的紅曲霉菌體，體積分數(shù)2.5%戊二醛溶液固定12 h后用0.1 mol/L pH 7.2磷酸鹽緩沖液漂洗2次，依次用30%、50%、70%、80%、90%和100%乙醇梯度脫水，醋酸異戊酯置換乙醇，置于HMDS中60℃烘箱干燥。離子濺射儀噴金，掃描電子顯微鏡觀察菌體微結(jié)構(gòu)形態(tài)（20 kV）[17-18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 初始菌株紫色紅曲霉M-1發(fā)酵產(chǎn)Monacolin K能力

配制0～200 mg/L的Monacolin K標準溶液，進行HPLC檢測。由圖1可知，Monacolin K出峰時間為12.5 min左右；以峰面積（y）對Monacolin K質(zhì)量濃度（x）進行線性回歸，其回歸方程為y＝31 104x+58 597（R2＝0.999），Monacolin K質(zhì)量濃度在10～200 mg/L范圍內(nèi)線性關系良好。根據(jù)Monacolin K標準曲線計算發(fā)酵13 d后初始菌株紫色紅曲霉M.purpureus M-1發(fā)酵液中Monacolin K產(chǎn)量為202.9 mg/L。

圖1 紫色紅曲霉M-1發(fā)酵液的HPLC圖Fig.1 HPLC chromatogram of the fermented broth of M.purpureus M-1 on the 13th day

2.2 紫色紅曲霉M-1誘變致死率的選擇

采用平板活菌計數(shù)法繪制紫色紅曲霉菌株的致死率曲線。由圖2可知，ARTP對紫色紅曲霉M-1菌株具有很強的致死效應，ARTP處理30 s紫色紅曲霉菌株誘變致死率達到84%，處理60 s后致死率基本穩(wěn)定在90%以上，處理180 s致死率接近100%。為獲得較高的正突變率以方便篩選，選取ARTP處理90 s（致死率約92.6%）作為后續(xù)處理的條件，經(jīng)計算得到突變率為42.9%，而正突變率較高，達到23.8%。

圖2 紫色紅曲霉M-1的致死率曲線Fig.2 Lethal rate curve of M.purpureus M-1

2.3 ARTP處理對紫色紅曲霉及其突變株的誘變效應

研究探討ARTP處理對紫色紅曲霉誘變效應，通過比較初始菌株與突變株的形態(tài)、孢子大小和菌絲體狀態(tài)分析其誘變機制。

2.3.1 ARTP誘變處理引起紫色紅曲霉菌落形態(tài)、色澤變化

圖3 紫色紅曲霉M-1經(jīng)ARTP誘變前（a）后（b）的菌落形態(tài)變化Fig.3 Colony changes before (a) and after (b) M-1 mutation

圖3a為初始菌株M-1的孢子懸液（稀釋100倍）涂布平板培養(yǎng)48 h后生長菌落，圖3b為初始菌株M-1經(jīng)ARTP誘變30 s后稀釋相同倍數(shù)涂布平板得到的菌落（稀釋100倍），可以看出經(jīng)誘變處理后菌落數(shù)明顯降低，且菌落形態(tài)發(fā)生了改變。紫色紅曲霉M-1菌落初期為白色，成熟后漸變?yōu)榈t至紅色，背面深紅；誘變后部分菌落直徑發(fā)生一定改變，色澤更白，中心有一些紅點，且繼續(xù)培養(yǎng)菌體狀態(tài)不再發(fā)生改變。

2.3.2 ARTP誘變處理引起菌體細胞的形態(tài)特征變化

圖4 紫色紅曲霉M-1經(jīng)ARTP誘變前后菌絲體及孢子形態(tài)變化Fig.4 Scanning electron micrographs of mycelia and spores ofM.purpureus M-1 before and after mutagenesis

圖4a、4b為誘變前后菌株M-1菌絲體形態(tài)比對結(jié)果，可以看出未經(jīng)ARTP處理的菌絲體茂盛飽滿，菌絲體有大量分枝，較少皺縮斷裂，菌絲體直徑為2～7 μm，菌絲由橫隔膜分隔成為成串多細胞，細胞幼時含有顆粒，老后含空泡及油滴，上述特征與俞艷玲等[19]的報道一致。且可觀察到不同時期閉囊殼和分生孢子的生長狀況（圖4a）；誘變處理后菌絲體存在形態(tài)學損傷，其皺縮、彎曲的程度都較未經(jīng)誘變的菌株更嚴重（圖4b），經(jīng)ARTP等離子體誘變處理150 s后，菌絲體表面出現(xiàn)明顯膨大或斷裂現(xiàn)象，形成多種形態(tài)的奇形菌絲，且孢子數(shù)目明顯減少。未經(jīng)誘變處理的菌絲體分枝頂端有單個或多個成鏈狀的分生孢子（圖4c），孢子呈球形或橢球形，直徑為4～10 μm；紫色紅曲霉的閉囊殼在生長期呈近球形，表面呈現(xiàn)粗網(wǎng)紋，直徑為25～75 μm，具柄且柄的長短不一，閉囊殼內(nèi)散生有多數(shù)子囊，成熟后子囊壁解體呈傘狀，孢子剩留在薄壁的子囊殼內(nèi)，子囊孢子卵形或橢球形，直徑為2～7.5 μm。誘變處理后（圖4d），紫色紅曲霉的分生孢子和閉囊殼在大小、形狀、直徑等方面均有明顯變化，表明ARTP產(chǎn)生的活性粒子透過細胞膜作用于DNA 物質(zhì)，引起DNA發(fā)生多樣性損傷，細胞DNA不完全修復突變，形成遺傳穩(wěn)定的突變株。

2.4 突變菌株篩選結(jié)果

2.4.1 誘變突變株的初篩

取誘變時間為90 s的菌懸液，稀釋、涂布平板、培養(yǎng)，根據(jù)ARTP誘變后菌落的大小、色澤、圓整度等生長狀態(tài)，初步篩選平板培養(yǎng)基上菌落形態(tài)與原菌株有明顯差異或生長較快的單菌落；淘汰菌落明顯偏小、生長速率慢、菌絲稀薄和易老化的菌落，上述特征與邱雯雯[20]、李滔滔[21]等的研究結(jié)果類似。搖瓶培養(yǎng)比較獲得的42株突變株產(chǎn)生Monacolin K的能力，其中突變株6、23、24、36菌株產(chǎn)生Monacolin K的能力較初始菌株M-1有明顯提高（圖5）。

圖5 初始菌株M-1及42株突變株產(chǎn)Monacolin K能力（搖瓶培養(yǎng)13 d）Fig.5 Monacolin K production of 42 mutants and the original strain during 13 days of shake flask cultivation

2.4.2 誘變突變株的復篩

圖6 初始菌株M-1與4株突變株Monacolin K產(chǎn)量的比較Fig.6 Comparison of monacolin K yields produced from four highyield mutants and the original strain

圖7 突變株23的菌體生物量及Monacolin K產(chǎn)量Fig.7 Biomass and monacolin K yield of mutant strain 23

將初始菌株M-1及其4株突變株進行搖瓶發(fā)酵復篩（5株菌株培養(yǎng)條件相同），突變株23的Monacolin K產(chǎn)量達到428.14 mg/L，較初始菌株M-1提高了111%（圖6）。如圖7所示，在發(fā)酵過程中，突變株23的菌體生物量較初始菌株M-1有一定提高；突變株23和初始菌株M-1的Monacolin K在2～3 d時開始積累，第6天后突變株23產(chǎn)生Monacolin K的速率明顯加強，表明紫色紅曲霉產(chǎn)生Monacolin K主要發(fā)生在菌體生長的穩(wěn)定期，此時次級代謝產(chǎn)物積累明顯增強，且突變株較原始菌株的菌體生物量明顯升高，因突變株23具有較強的產(chǎn)Monacolin K能力，故菌體細胞對于次級代謝產(chǎn)物Monacolin K的耐受性較高，在利用發(fā)酵液不斷合成Monacolin K的過程中延遲到達細胞成熟期，菌體生物量進一步積累也是Monacolin K產(chǎn)量提高的關鍵。到達第14天時，Monacolin K的合成量趨于穩(wěn)定，此時部分細胞發(fā)生裂解死亡，從而引起產(chǎn)量的細微波動。王蘭等[22]經(jīng)過紫外輻射、氯化鋰、亞硝酸和硫酸二乙酯等誘變條件處理紅曲霉菌株，最終得到具有較高產(chǎn)Monacolin K能力的誘變菌株W283，其Monacolin K的產(chǎn)量為402.1 mg/L，與出發(fā)菌株相比提高了53.1%，本研究所得結(jié)果與其持平。

3 結(jié) 論

本研究探討了ARTP射流誘變技術(shù)處理紫色紅曲霉菌株M-1，選育高產(chǎn)Monacolin K突變株的效果。結(jié)果表明，ARTP對紫色紅曲霉菌株具有較強致死和致突變效應，ARTP處理90 s時其致死率約為92.6%；突變率為42.9%，正突變率達到23.8%，篩選獲得的突變株23的Monacolin K產(chǎn)量達到428.14 mg/L，較初始菌株M-1提高了111%。ARTP作用于紫色紅曲霉不僅可引起其形態(tài)學特征發(fā)生改變，突變株的菌落色澤、菌絲體和孢子形態(tài)等超微結(jié)構(gòu)特征也均有一定變化；ARTP產(chǎn)生的活性粒子可透過細胞膜作用于DNA 物質(zhì)，引起DNA發(fā)生多樣性損傷，造成細胞DNA不完全修復突變，導致合成Monacolin K的部分調(diào)控基因發(fā)生堿基錯配重排等情況繼而高效表達，形成遺傳穩(wěn)定的突變株。

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