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        常壓室溫等離子體誘變技術(shù)選育高產(chǎn)Monacolin K紫色紅曲霉突變株

        2015-01-30 07:36:08祁田甜胡濟美郎天丹王成濤趙吉興
        食品科學 2015年9期
        關鍵詞:突變率致死率曲霉菌

        祁田甜,張 嬋,,*,胡濟美,郎天丹,王成濤,,*,趙吉興

        (1.北京工商大學 北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心,北京 100048;2.北京工商大學 食品質(zhì)量與安全北京實驗室,北京 100048;3.中國國際工程咨詢公司,北京 100048;4.山東中惠食品有限公司,山東 濱州 251706)

        紅曲類產(chǎn)品在我國的生產(chǎn)和使用已有1 000多年歷史,廣泛用于釀酒、食品著色、醫(yī)藥等方面[1]。紫色紅曲霉(Monascus purpureus Went.)屬于真菌門子囊菌綱真子囊菌亞綱紅曲霉屬,能夠產(chǎn)生多種對人體有益的次級代謝產(chǎn)物,如膽固醇合成抑制劑Monacolin K、紅曲色素、麥角固醇、γ-氨基丁酸等。1979年日本學者Endo[2]首次從紅色紅曲霉(Monascus ruber)的培養(yǎng)液中分離出能有效抑制膽固醇合成關鍵酶——羥甲基戊二酸單酰輔酶A(3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A,HMG-CoA)還原酶的化合物Monacolin K。Monacolin K(又稱洛伐他汀,lovastatin)是一種曲霉菌屬合成的次級代謝產(chǎn)物,因其結(jié)構(gòu)與HMG-CoA的結(jié)構(gòu)相類似,可競爭性地抑制膽固醇合成途徑中HMG-CoA還原酶的活性,因此具有抑制人體膽固醇合成、降血脂的作用[3-4],且具有高效、低毒、安全等特點[5]。

        清華大學與北京思清源公司合作研發(fā)出新型常壓室溫等離子體(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)誘變系統(tǒng),通過發(fā)射均勻且粒子豐富的等離子體射流,使活性粒子透過細胞膜作用于DNA物質(zhì),引起DNA的多樣性損傷,細胞中的DNA不完全修復形成遺傳穩(wěn)定的突變株。ARTP具有射流溫度低(25~35℃)、活性粒子分布均勻、對人體和環(huán)境無危害的特點,與真空條件下運作的常規(guī)低壓離子束植入操作系統(tǒng)相比,由于除去了復雜和昂貴的真空系統(tǒng),常壓室溫等離子技術(shù)可以在一個非常小的環(huán)境內(nèi)以惰性氣體為基礎的等離子體射流區(qū)域中進行,并且可以提高操作的安全性,同時控制不同的劑量[6-7]。研究結(jié)果表明,ARTP誘變使黑曲霉產(chǎn)脂肪酶的比活力比出發(fā)菌株提高約37%,獲得產(chǎn)油酵母突變株表現(xiàn)出比野生型更高的生長速率和更高的油脂產(chǎn)量,且正突變率超過30%,構(gòu)建高產(chǎn)琥珀酸的大腸桿菌工程菌產(chǎn)量達到0.87 g/g[8-10]。由于其獨特的功能和潛在的應用價值,ARTP誘變系統(tǒng)被應用于許多領域,如生物、化學凈化劑和熱敏感性醫(yī)療儀器消毒方面[11],已然成為生物誘變育種領域的一個研究熱點。本實驗將ARTP誘變技術(shù)應用于紅曲霉菌株育種,期望能篩選得到一株高產(chǎn)Monacolin K的突變株,為Monacolin K及降膽固醇藥物的生產(chǎn)提供支持。

        1 材料與方法

        1.1 菌種、培養(yǎng)基與試劑

        紫色紅曲霉Monascus purpureus M-1,由本實驗室篩選、保存。

        斜面培養(yǎng)基:葡萄糖20 g/L、酵母提取物4 g/L、蛋白胨3 g/L、麥芽浸粉20 g/L、KH2PO42 g/L、瓊脂15 g/L,自然pH值。

        平板活化培養(yǎng)基:葡萄糖20 g/L、酵母提取物4 g/L、蛋白胨3 g/L、麥芽浸粉20 g/L、KH2PO42 g/L、瓊脂15 g/L,自然pH值。

        種子培養(yǎng)基:葡萄糖30 g/L、黃豆粉15 g/L、MgSO41 g/L、甘油70 mL/L、蛋白胨10 g/L、NaNO32 g/L、KH2PO42 g/L,自然pH值。

        發(fā)酵培養(yǎng)基:甘油90 mL/L、大米粉水解液20 mL/L、蛋白胨10 g/L、NaNO35 g/L、MgSO41 g/L、ZnSO42 g/L、KH2PO42.5 g/L,乳酸調(diào)pH 4.5。

        Monacolin K標準品 美國Sigma公司;NaCl、NaH2PO4、Na2HPO4、NaNO3、KH2PO4、MgSO4、ZnSO4、25%戊二醛、醋酸異戊酯、乙醇、六甲基二硅胺(hexamethyldisilazane,HMDS) 國藥集團化學試劑有限公司;酵母提取物、蛋白胨、麥芽浸粉、甘油北京奧博星生物技術(shù)有限公司;甲醇(色譜純) 美國Fisher公司。

        1.2 儀器與設備

        LC-20AT高效液相色譜儀、WondaSilTMC18柱(4.6 mm×150 mm,5 μm) 日本島津公司;VEGA 3LMU/LMH掃描電子顯微鏡 捷克Tescan公司;GT10-1高速離心機 上海安亭科學儀器廠;BPH-9082恒溫培養(yǎng)箱 德國Eppendorf New Brunswick公司;OBY-H160-SE1恒溫恒濕培養(yǎng)箱 常州歐邦電子有限公司;DL-CJ-1NDII 2NDI 2NDII超凈工作臺 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司;DHG-9620B智能電熱恒溫鼓風干燥箱 上?,槴\實驗設備有限公司;DSX-280B立式壓力蒸汽滅菌器上海申安醫(yī)療器械廠;M-pact AX124分析天平 上海歡奧科技公司;常壓室溫等離子體誘變育種機 北京思清源生物科技有限公司;Eiko IB-3型離子濺射儀 日本EIKO公司。

        1.3 方法

        1.3.1 ARTP誘變處理[12]

        將試管斜面30℃活化7 d的紫色紅曲霉菌體用無菌生理鹽水沖洗、過濾,孢子懸液濃度調(diào)節(jié)至106~107個/mL,添加甘油至體積分數(shù)為5%。將菌懸液均勻涂抹在金屬載片表面,用鑷子將菌物載片轉(zhuǎn)移到載物臺,設定參數(shù)在工作氣流量為10 L/min,等離子體發(fā)射源與樣品距離為2 mm,操作溫度23.0~35.0℃的條件下,分別照射0、30、60、75、90、120、150、180 s,處理后將載片轉(zhuǎn)移到裝有1 mL生理鹽水的EP管中,振蕩洗脫形成新的菌懸液,不同梯度稀釋后涂布平板,培養(yǎng)48 h后觀察菌落形態(tài)特征。采用平板活菌計數(shù)法(CFU法)來計算ARTP處理的致死率,獲得致死曲線。

        1.3.2 突變菌株篩選

        將ARTP誘變處理的菌懸液稀釋涂布平板,30℃恒溫培養(yǎng)3 d。選取單個菌落接入試管種子培養(yǎng)基,于30℃、200 r/min條件下培養(yǎng)48 h,接種后于30℃、150 r/min搖床培養(yǎng)13 d,取發(fā)酵液用高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)法檢測Monacolin K產(chǎn)量。

        1.3.3 分析檢測方法

        1.3.3.1 平板活菌計數(shù)法測定菌體濃度

        誘變后菌懸液稀釋至10-1、10-2、10-33個梯度,每個梯度3~5個涂布平板,30℃培養(yǎng)2 d后計數(shù),根據(jù)存活菌體數(shù),按照公式(1)計算致死率[4]。

        式中:U為未經(jīng)ARTP處理的平板菌落數(shù)/(CFU/μL);T為ARTP處理后的平板菌落數(shù)/(CFU/μL)。

        誘變菌株突變率計算:以Monacolin K的產(chǎn)量為標準,將產(chǎn)量降低或提高20%以上的誘變菌株定義為突變株[13],按照公式(2)、(3)計算菌株突變率和正突變率。

        1.3.3.2 Monacolin K產(chǎn)量及菌體生物量測定

        標準品預處理:準確稱量Monacolin K標準品溶于75%甲醇配制成200 mg/L標準溶液,0.45 μm有機微孔濾膜過濾,進樣檢測。

        發(fā)酵液預處理:取培養(yǎng)13 d的發(fā)酵液5 mL加入15 mL 75%甲醇,200 W超聲波輔助萃取30 min,靜置過夜,10 000 r/min離心,0.45 μm有機微孔濾膜過濾,取濾液用HPLC法檢測Monacolin K含量。

        HPLC檢測條件[14-15]:WondaSilTMC18色譜柱(4.6 mm×150 mm,5 μm);流動相:甲醇-0.1%磷酸(3∶1,V/V),流速l mL/min,紫外檢測器檢測波長238 nm,柱溫箱30℃,進樣量10 μL。

        [16],采用菌絲體干質(zhì)量法測定發(fā)酵1~10 d的菌體生物量。

        1.3.3.3 掃描電子顯微鏡檢測菌體形態(tài)

        培養(yǎng)8 d的紅曲霉菌體,體積分數(shù)2.5%戊二醛溶液固定12 h后用0.1 mol/L pH 7.2磷酸鹽緩沖液漂洗2次,依次用30%、50%、70%、80%、90%和100%乙醇梯度脫水,醋酸異戊酯置換乙醇,置于HMDS中60℃烘箱干燥。離子濺射儀噴金,掃描電子顯微鏡觀察菌體微結(jié)構(gòu)形態(tài)(20 kV)[17-18]。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 初始菌株紫色紅曲霉M-1發(fā)酵產(chǎn)Monacolin K能力

        配制0~200 mg/L的Monacolin K標準溶液,進行HPLC檢測。由圖1可知,Monacolin K出峰時間為12.5 min左右;以峰面積(y)對Monacolin K質(zhì)量濃度(x)進行線性回歸,其回歸方程為y=31 104x+58 597(R2=0.999),Monacolin K質(zhì)量濃度在10~200 mg/L范圍內(nèi)線性關系良好。根據(jù)Monacolin K標準曲線計算發(fā)酵13 d后初始菌株紫色紅曲霉M.purpureus M-1發(fā)酵液中Monacolin K產(chǎn)量為202.9 mg/L。

        圖1 紫色紅曲霉M-1發(fā)酵液的HPLC圖Fig.1 HPLC chromatogram of the fermented broth of M.purpureus M-1 on the 13th day

        2.2 紫色紅曲霉M-1誘變致死率的選擇

        采用平板活菌計數(shù)法繪制紫色紅曲霉菌株的致死率曲線。由圖2可知,ARTP對紫色紅曲霉M-1菌株具有很強的致死效應,ARTP處理30 s紫色紅曲霉菌株誘變致死率達到84%,處理60 s后致死率基本穩(wěn)定在90%以上,處理180 s致死率接近100%。為獲得較高的正突變率以方便篩選,選取ARTP處理90 s(致死率約92.6%)作為后續(xù)處理的條件,經(jīng)計算得到突變率為42.9%,而正突變率較高,達到23.8%。

        圖2 紫色紅曲霉M-1的致死率曲線Fig.2 Lethal rate curve of M.purpureus M-1

        2.3 ARTP處理對紫色紅曲霉及其突變株的誘變效應

        研究探討ARTP處理對紫色紅曲霉誘變效應,通過比較初始菌株與突變株的形態(tài)、孢子大小和菌絲體狀態(tài)分析其誘變機制。

        2.3.1 ARTP誘變處理引起紫色紅曲霉菌落形態(tài)、色澤變化

        圖3 紫色紅曲霉M-1經(jīng)ARTP誘變前(a)后(b)的菌落形態(tài)變化Fig.3 Colony changes before (a) and after (b) M-1 mutation

        圖3a為初始菌株M-1的孢子懸液(稀釋100倍)涂布平板培養(yǎng)48 h后生長菌落,圖3b為初始菌株M-1經(jīng)ARTP誘變30 s后稀釋相同倍數(shù)涂布平板得到的菌落(稀釋100倍),可以看出經(jīng)誘變處理后菌落數(shù)明顯降低,且菌落形態(tài)發(fā)生了改變。紫色紅曲霉M-1菌落初期為白色,成熟后漸變?yōu)榈t至紅色,背面深紅;誘變后部分菌落直徑發(fā)生一定改變,色澤更白,中心有一些紅點,且繼續(xù)培養(yǎng)菌體狀態(tài)不再發(fā)生改變。

        2.3.2 ARTP誘變處理引起菌體細胞的形態(tài)特征變化

        圖4 紫色紅曲霉M-1經(jīng)ARTP誘變前后菌絲體及孢子形態(tài)變化Fig.4 Scanning electron micrographs of mycelia and spores ofM.purpureus M-1 before and after mutagenesis

        圖4a、4b為誘變前后菌株M-1菌絲體形態(tài)比對結(jié)果,可以看出未經(jīng)ARTP處理的菌絲體茂盛飽滿,菌絲體有大量分枝,較少皺縮斷裂,菌絲體直徑為2~7 μm,菌絲由橫隔膜分隔成為成串多細胞,細胞幼時含有顆粒,老后含空泡及油滴,上述特征與俞艷玲等[19]的報道一致。且可觀察到不同時期閉囊殼和分生孢子的生長狀況(圖4a);誘變處理后菌絲體存在形態(tài)學損傷,其皺縮、彎曲的程度都較未經(jīng)誘變的菌株更嚴重(圖4b),經(jīng)ARTP等離子體誘變處理150 s后,菌絲體表面出現(xiàn)明顯膨大或斷裂現(xiàn)象,形成多種形態(tài)的奇形菌絲,且孢子數(shù)目明顯減少。未經(jīng)誘變處理的菌絲體分枝頂端有單個或多個成鏈狀的分生孢子(圖4c),孢子呈球形或橢球形,直徑為4~10 μm;紫色紅曲霉的閉囊殼在生長期呈近球形,表面呈現(xiàn)粗網(wǎng)紋,直徑為25~75 μm,具柄且柄的長短不一,閉囊殼內(nèi)散生有多數(shù)子囊,成熟后子囊壁解體呈傘狀,孢子剩留在薄壁的子囊殼內(nèi),子囊孢子卵形或橢球形,直徑為2~7.5 μm。誘變處理后(圖4d),紫色紅曲霉的分生孢子和閉囊殼在大小、形狀、直徑等方面均有明顯變化,表明ARTP產(chǎn)生的活性粒子透過細胞膜作用于DNA 物質(zhì),引起DNA發(fā)生多樣性損傷,細胞DNA不完全修復突變,形成遺傳穩(wěn)定的突變株。

        2.4 突變菌株篩選結(jié)果

        2.4.1 誘變突變株的初篩

        取誘變時間為90 s的菌懸液,稀釋、涂布平板、培養(yǎng),根據(jù)ARTP誘變后菌落的大小、色澤、圓整度等生長狀態(tài),初步篩選平板培養(yǎng)基上菌落形態(tài)與原菌株有明顯差異或生長較快的單菌落;淘汰菌落明顯偏小、生長速率慢、菌絲稀薄和易老化的菌落,上述特征與邱雯雯[20]、李滔滔[21]等的研究結(jié)果類似。搖瓶培養(yǎng)比較獲得的42株突變株產(chǎn)生Monacolin K的能力,其中突變株6、23、24、36菌株產(chǎn)生Monacolin K的能力較初始菌株M-1有明顯提高(圖5)。

        圖5 初始菌株M-1及42株突變株產(chǎn)Monacolin K能力(搖瓶培養(yǎng)13 d)Fig.5 Monacolin K production of 42 mutants and the original strain during 13 days of shake flask cultivation

        2.4.2 誘變突變株的復篩

        圖6 初始菌株M-1與4株突變株Monacolin K產(chǎn)量的比較Fig.6 Comparison of monacolin K yields produced from four highyield mutants and the original strain

        圖7 突變株23的菌體生物量及Monacolin K產(chǎn)量Fig.7 Biomass and monacolin K yield of mutant strain 23

        將初始菌株M-1及其4株突變株進行搖瓶發(fā)酵復篩(5株菌株培養(yǎng)條件相同),突變株23的Monacolin K產(chǎn)量達到428.14 mg/L,較初始菌株M-1提高了111%(圖6)。如圖7所示,在發(fā)酵過程中,突變株23的菌體生物量較初始菌株M-1有一定提高;突變株23和初始菌株M-1的Monacolin K在2~3 d時開始積累,第6天后突變株23產(chǎn)生Monacolin K的速率明顯加強,表明紫色紅曲霉產(chǎn)生Monacolin K主要發(fā)生在菌體生長的穩(wěn)定期,此時次級代謝產(chǎn)物積累明顯增強,且突變株較原始菌株的菌體生物量明顯升高,因突變株23具有較強的產(chǎn)Monacolin K能力,故菌體細胞對于次級代謝產(chǎn)物Monacolin K的耐受性較高,在利用發(fā)酵液不斷合成Monacolin K的過程中延遲到達細胞成熟期,菌體生物量進一步積累也是Monacolin K產(chǎn)量提高的關鍵。到達第14天時,Monacolin K的合成量趨于穩(wěn)定,此時部分細胞發(fā)生裂解死亡,從而引起產(chǎn)量的細微波動。王蘭等[22]經(jīng)過紫外輻射、氯化鋰、亞硝酸和硫酸二乙酯等誘變條件處理紅曲霉菌株,最終得到具有較高產(chǎn)Monacolin K能力的誘變菌株W283,其Monacolin K的產(chǎn)量為402.1 mg/L,與出發(fā)菌株相比提高了53.1%,本研究所得結(jié)果與其持平。

        3 結(jié) 論

        本研究探討了ARTP射流誘變技術(shù)處理紫色紅曲霉菌株M-1,選育高產(chǎn)Monacolin K突變株的效果。結(jié)果表明,ARTP對紫色紅曲霉菌株具有較強致死和致突變效應,ARTP處理90 s時其致死率約為92.6%;突變率為42.9%,正突變率達到23.8%,篩選獲得的突變株23的Monacolin K產(chǎn)量達到428.14 mg/L,較初始菌株M-1提高了111%。ARTP作用于紫色紅曲霉不僅可引起其形態(tài)學特征發(fā)生改變,突變株的菌落色澤、菌絲體和孢子形態(tài)等超微結(jié)構(gòu)特征也均有一定變化;ARTP產(chǎn)生的活性粒子可透過細胞膜作用于DNA 物質(zhì),引起DNA發(fā)生多樣性損傷,造成細胞DNA不完全修復突變,導致合成Monacolin K的部分調(diào)控基因發(fā)生堿基錯配重排等情況繼而高效表達,形成遺傳穩(wěn)定的突變株。

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