曾 超，邱樹毅，胡寶東，陳美竹，徐 佳，王曉丹，3*

（1.貴州大學(xué) 貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；3.貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025）

白酒是我國(guó)傳統(tǒng)的蒸餾酒，是世界七大蒸餾酒之一，在白酒釀造過(guò)程中，無(wú)論是液態(tài)、半固態(tài)，還是固態(tài)發(fā)酵法，在進(jìn)行堆積、發(fā)酵過(guò)程中，經(jīng)過(guò)不斷地馴化和發(fā)酵，酒醅和窖池都會(huì)形成獨(dú)有的適合厭氧微生物生長(zhǎng)的厭氧環(huán)境，厭氧微生物不斷地代謝繁殖生長(zhǎng)，進(jìn)而形成一系列厭氧微生物體系，在堆積、發(fā)酵過(guò)程中必然發(fā)揮著重要的作用，由于厭氧菌是一類在無(wú)氧條件下比在有氧環(huán)境中生長(zhǎng)好的細(xì)菌，這類細(xì)菌缺乏完整的代謝酶體系，其能量代謝以無(wú)氧發(fā)酵的方式進(jìn)行，在發(fā)酵過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生乙醇、乳酸、己酸等，就必然會(huì)影響釀酒體系中的pH值和白酒的風(fēng)味。因此對(duì)白酒釀造體系中酒醅和窖池的厭氧微生物的研究是很有現(xiàn)實(shí)意義的。然而由于厭氧微生物在有氧存在的情況下基本不生長(zhǎng)或者死亡，對(duì)厭氧微生物的厭氧環(huán)境很難保證，這就給分離篩選出純種厭氧微生物帶來(lái)了更大的困難。直到最近二十年，由于自動(dòng)厭氧手套箱的出現(xiàn)，再加上新技術(shù)新方法的應(yīng)用，對(duì)厭氧微生物的研究取得了很大的進(jìn)展，并獲得了一系列豐碩的成果[1]。

厭氧微生物是一大群專性厭氧，必須在無(wú)氧環(huán)境中才能生長(zhǎng)的微生物，一般主要是細(xì)菌。霉菌和酵母均是好氧或兼性厭氧菌[2]。厭氧微生物主要可分為兩大類[3]：一類是革蘭染色陽(yáng)性有芽胞的厭氧芽胞梭菌，另一類是無(wú)芽胞的革蘭陽(yáng)性及革蘭陰性球菌與桿菌。前一類因有芽胞，抵抗力強(qiáng)，在自然界（水、土等）、動(dòng)物及人體腸道中廣泛存在，并且能長(zhǎng)期耐受惡劣的環(huán)境條件，在窖泥、酒醅中均有發(fā)現(xiàn)；后一類則是人體的正常菌群，可與需氧菌、兼性厭氧菌共同存在于口腔、腸道、上呼吸道、泌尿生殖道等，這類無(wú)芽胞厭氧菌的致病性屬于條件致病性的內(nèi)源性感染，在長(zhǎng)期使用抗生素、激素、免疫抑制劑等發(fā)生菌群失調(diào)或機(jī)體免疫力衰退時(shí)，或細(xì)菌進(jìn)入非正常寄居部位時(shí)才可致病。本文主要對(duì)現(xiàn)階段厭氧微生物的培養(yǎng)技術(shù)及其白酒釀造體系厭氧微生物的研究現(xiàn)狀做概述，為相關(guān)研究的順利開展提供理論依據(jù)。

1 厭氧微生物培養(yǎng)技術(shù)的研究

厭氧菌培養(yǎng)日益引起臨床細(xì)菌檢驗(yàn)人員的重視。厭氧曲培養(yǎng)的一個(gè)關(guān)鍵性問(wèn)題就是厭氧條件是否合格，只有厭氧條件合格才能提高厭氧菌的分離率[4]。目前厭氧微生物的培養(yǎng)技術(shù)主要有平板厭氧技術(shù)（主要包括平皿夾層厭氧法、平板培養(yǎng)瓶厭氧技術(shù)）、亨蓋特（Hungate）滾管技術(shù)、厭氧手套箱技術(shù)等。

1.1 平板厭氧技術(shù)[5]

1.1.1 平皿夾層厭氧法

平皿夾層厭氧法具體操作是：將瓊脂培養(yǎng)基滅菌后，倒入平板中（三分之一左右），再將不同梯度的菌懸液分別取0.1 mL涂布于平板上（同好氣操作），讓菌懸液滲透10 min，再倒入瓊脂培養(yǎng)基至剛好未溢出的狀態(tài)，蓋上皿蓋并下壓，排除皿內(nèi)的氣泡，使其達(dá)到嚴(yán)格厭氧狀態(tài)，并用瓊脂密封皿口培養(yǎng)。穆軍等[6]結(jié)合常規(guī)好氧細(xì)菌和嚴(yán)格厭氧細(xì)菌分離純化方法的優(yōu)點(diǎn)，設(shè)計(jì)了平皿夾層厭氧法，并將之成功地運(yùn)用于硫酸鹽還原細(xì)菌（嚴(yán)格厭氧）和脫氮硫桿菌（兼性厭氧）菌株的分離純化。

1.1.2 平板培養(yǎng)瓶厭氧技術(shù)[7]

平板培養(yǎng)瓶厭氧技術(shù)是利用寬體窄頸瓶形成培養(yǎng)瓶底部的平面，進(jìn)行菌液涂布或滴加菌滴并輕搖涂布法，用氮?dú)獯得撆囵B(yǎng)瓶?jī)?nèi)空氣（氧氣）。配制培養(yǎng)基過(guò)程中，利用加熱煮沸驅(qū)逐液相溶解氧和利用氮?dú)獯得撈績(jī)?nèi)氣相空氣的方式，保證嚴(yán)格厭氧，加瓊脂0.2%～0.5%，吸收多余水分。全部實(shí)驗(yàn)操作采用吹氮?dú)饷撗鹾图訜狎?qū)氧法。韓靜等[8]通過(guò)利用簡(jiǎn)單的酸處理與熱處理相結(jié)合的方法，并結(jié)合平面厭氧操作技術(shù)與培養(yǎng)瓶厭氧技術(shù)，成功的分離得到了一株高溫產(chǎn)氫菌。此菌在45～50 ℃范圍內(nèi)具有較強(qiáng)的產(chǎn)氫能力。此菌為高溫產(chǎn)氫菌，并且在85 ℃下處理10 min后仍然具有一定的活性，這有利于簡(jiǎn)化菌種的純化，但是操作繁瑣，厭氧環(huán)境不易控制，很難達(dá)到厭氧菌的生長(zhǎng)條件。該方法雖然能分離出嚴(yán)格厭氧菌，但使用并不廣泛。

1.2 亨蓋特（Hungate）滾管技術(shù)

亨蓋特厭氧滾管技術(shù)主要原理是管內(nèi)的銅柱不斷被氧化被還原以實(shí)現(xiàn)除氧的目的，達(dá)到無(wú)氧狀態(tài)。與亨蓋特厭氧滾管技術(shù)相比，厭氧袋、厭氧罐的除氧效果不太理想，很難保證厭氧微生物所需的無(wú)氧狀態(tài)，厭氧箱價(jià)格昂貴，設(shè)備維護(hù)費(fèi)用較高。亨蓋特厭氧滾管技術(shù)是一種能夠達(dá)到無(wú)氧狀態(tài)，操作較簡(jiǎn)便的理想的分離篩選各種厭氧微生物的方法。李平蘭等[9]成功利用亨蓋特厭氧滾管技術(shù)檢測(cè)雙歧桿菌制品中的活菌數(shù)。鄧功成等[10]采用亨蓋特厭氧滾管技術(shù)，從厭氧消化器中分離得到嚴(yán)格厭氧微生物甲烷菌。結(jié)果顯示，亨蓋特厭氧滾管分離培養(yǎng)技術(shù)方法可靠，分離的效果好，適用于各種嚴(yán)格厭氧微生物的分離純化。

1.3 厭氧手套箱技術(shù)[11]

手動(dòng)厭氧箱：其操作是關(guān)閉交換室內(nèi)門，外門打開，將物品放入交換室，再關(guān)閉外門，啟動(dòng)抽氣泵，抽去箱內(nèi)的空氣，待壓力計(jì)指針接近不動(dòng)，關(guān)閉抽氣泵，打開箱內(nèi)進(jìn)氮?dú)獍粹o，待氮?dú)獬錆M操作室時(shí)，關(guān)閉箱內(nèi)進(jìn)氮?dú)獍粹o，再打開抽氣泵，如此循環(huán)3～5次后，再打開室內(nèi)混合氣按鈕，充進(jìn)混合氣，過(guò)道同室內(nèi)操作相同。操作完畢后，打開內(nèi)門，將物品放入操作室，關(guān)閉內(nèi)門，打開外門，取出物品。再進(jìn)行室內(nèi)和過(guò)道混合氣微調(diào)，使厭氧工作站達(dá)到厭氧狀態(tài)。該方法操作繁瑣，每次放樣都要進(jìn)行幾次抽氣、換氣，從而消耗氣體量很大，操作過(guò)程不是直接接觸儀器，而是通過(guò)厭氧手套來(lái)進(jìn)行，操作難度大，而且厭氧手套箱價(jià)格較昂貴，成本較大，不適宜進(jìn)行厭氧菌的分離。

自動(dòng)厭氧手套箱：一旦儀器安裝完畢，只要打開啟動(dòng)按鈕，操作室的換氣操作可自動(dòng)進(jìn)行，只需厭氧指示劑來(lái)指示其是否達(dá)到厭氧狀態(tài)，操作極其簡(jiǎn)單。雖然該方法消耗氣體較多，成本較大。該方法能夠克服厭氧環(huán)境難以形成的問(wèn)題，操作及其培養(yǎng)都在厭氧手套箱中，能夠直接通過(guò)手與儀器接觸進(jìn)行操作，操作方便，較前面幾種方法更容易培養(yǎng)出嚴(yán)格厭氧菌。該方法適用于酒醅、窖泥中厭氧細(xì)菌的分離純化。

2 白酒釀造體系厭氧微生物的研究現(xiàn)狀

在白酒釀造中，根據(jù)微生物學(xué)研究，分析出酒曲以霉菌、酵母的作用為主[12]，對(duì)酒曲中的厭氧微生物尚未見(jiàn)報(bào)道。而窖泥以細(xì)菌的作用為主，主要為乳桿菌和己酸菌，酒醅中的微生物主要來(lái)自酒曲及窖泥，受環(huán)境影響大、菌群復(fù)雜。以下主要對(duì)在白酒釀造中，窖泥、酒醅中的厭氧微生物做了簡(jiǎn)單的概述。

2.1 窖泥厭氧微生物的研究

傳統(tǒng)濃香型大曲酒采用泥窖發(fā)酵，其原因就是窖泥中棲息著大量的微生物，窖泥微生物的種類、數(shù)量、種群間的相互作用以及代謝的多樣性直接影響著白酒的質(zhì)量[13]。在濃香型白酒窖池微生物類群中，以細(xì)菌的作用為主，且大多為厭氧及兼性厭氧菌，其中對(duì)白酒香氣形成貢獻(xiàn)最大的是梭狀芽孢桿菌，其主要代謝產(chǎn)物是己酸、丁酸和氫。此外，還有異養(yǎng)菌、多種產(chǎn)甲烷菌、甲烷氧化菌、乳酸菌、各類發(fā)酵菌等，且發(fā)現(xiàn)己酸菌和甲烷菌共生時(shí)可促進(jìn)己酸的生成。由此可見(jiàn)，影響濃香型白酒香氣產(chǎn)生的主要微生物表現(xiàn)為厭氧菌和兼性厭氧菌[14]。

易彬等[15]通過(guò)對(duì)不同窖齡窖泥微生態(tài)變化研究表明：窖壁泥的好氧細(xì)菌數(shù)量和窖底泥的好氧芽孢細(xì)菌數(shù)量均隨著窖齡的增加呈逐漸降低趨勢(shì)，而窖壁泥的好氧芽孢細(xì)菌數(shù)量和窖底泥的好氧細(xì)菌數(shù)量均隨著窖齡的增加呈先降后升的趨勢(shì)；窖底泥的厭氧細(xì)菌和厭氧芽孢細(xì)菌以及窖壁泥的厭氧芽孢細(xì)菌數(shù)量隨著窖齡的增加呈逐漸增加的趨勢(shì)，不同窖齡的窖壁泥的厭氧細(xì)菌數(shù)量沒(méi)有明顯差異；不同窖齡的窖泥的好氧細(xì)菌、好氧芽孢細(xì)菌、厭氧細(xì)菌以及厭氧芽孢細(xì)菌數(shù)量總趨勢(shì)為窖底泥顯著高于窖壁泥；不同窖齡的窖泥中的霉菌和酵母菌數(shù)量均較少。趙輝等[16]從東北地區(qū)某酒廠優(yōu)質(zhì)窖泥中采用兼性厭氧培養(yǎng)及微量成分分析的方法，分離篩選出3株（C78、a57、A17）高產(chǎn)己酸的兼性厭氧細(xì)菌，其產(chǎn)己酸量分別為：213.691 4 mg/100 mL、170.465 mg/100 mL、103.509 7 mg/100 mL。經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化特征和分子生物學(xué)鑒定其分別為：巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）、梭狀芽孢桿菌（Bacillus fusiformis）及地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）。徐占成等[17]從劍南春老窖泥中分離到產(chǎn)己酸的一株菌株，經(jīng)過(guò)貝勞格微生物鑒定系統(tǒng)鑒定為“Clostridium cocleatum”即耳渦形梭菌。耳渦形梭菌是生成己酸的主要菌種之一，該菌種的生理生化特性上與克拉瓦氏菌有明顯的不同，在分類學(xué)上也有較遠(yuǎn)的距離。并不與甲烷菌互利共生，普遍存在于濃香型窖泥中，耳渦形梭菌是至今行業(yè)內(nèi)首次確定己酸菌的科學(xué)名稱，是我國(guó)釀酒行業(yè)的重大發(fā)現(xiàn)。為了認(rèn)識(shí)窖泥厭氧微生物，王贊等[18]從濃香型白酒窖泥中分離篩選出3株厭氧細(xì)菌，對(duì)其進(jìn)行菌落形態(tài)觀察、顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和對(duì)其進(jìn)行生理生化檢測(cè)，參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》對(duì)3株厭氧菌進(jìn)行初步鑒定，并確定其分別為：乳桿菌屬（Lactobacillus），束村氏菌屬（Tsukamurella），芽孢乳桿菌屬（Sporolactobacillus）。

2.2 酒醅厭氧微生物的研究

酒醅是已發(fā)酵完畢等待蒸的物料，其微生物菌系來(lái)自于酒曲、窖泥以及現(xiàn)場(chǎng)生產(chǎn)環(huán)境。由于中國(guó)傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵白酒生產(chǎn)的工藝特殊性，以及相關(guān)研究技術(shù)及手段受生產(chǎn)地域、發(fā)酵周期、產(chǎn)品風(fēng)格等多方面因素的限制，加之酒醅微生物區(qū)系研究的鑒定工作量相當(dāng)浩大，對(duì)其探討相對(duì)較少[19]。酒醅在窖泥微生物的不斷馴化下，也逐漸形成了獨(dú)有的厭氧微生物體系，對(duì)于酒的風(fēng)味起著不可替代的作用。

酒醅微生物區(qū)系是白酒釀造體系中微生物多樣性研究的重點(diǎn)，其產(chǎn)生的酶類、脂類、酸類構(gòu)成了酒體風(fēng)味物質(zhì)的前提[20]。學(xué)者對(duì)瀘州老窖、五糧液等著名濃香型白酒的糟醅微生物進(jìn)行了比較深入的研究，成功運(yùn)用變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）及指紋圖譜技術(shù)監(jiān)測(cè)酒糟微生物區(qū)系的分布、消長(zhǎng)等動(dòng)態(tài)變化過(guò)程[18]。結(jié)果表明，細(xì)菌多分布于酒醅上層，酵母菌及厭氧細(xì)菌主要分布于酒醅下層，霉菌較少；好氧細(xì)菌、兼性厭氧細(xì)菌、霉菌和酵母菌的數(shù)量在發(fā)酵初期增長(zhǎng)較快，各類微生物的數(shù)量隨著發(fā)酵的進(jìn)行均有所減少；在發(fā)酵中期，兼性厭氧細(xì)菌、酵母菌先后成為優(yōu)勢(shì)菌群；臨近出窖時(shí)，酵母菌數(shù)減少，芽孢桿菌數(shù)增加，發(fā)酵后期基本上已不能檢出霉菌[21]。

李光輝等[22]利用貝勞格（BIOLOG）自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)對(duì)濃香型白酒酒醅微生物群落代謝進(jìn)行分析。結(jié)果表明，入窖發(fā)酵2～4周期間，下層酒醅微生物群落代謝活性呈先降后升的變化趨勢(shì)，功能多樣性呈先升后降的變化趨勢(shì)，而且酒醅微生物功能多樣性的增加與pH值的顯著降低之間也存在著一定的聯(lián)系。吳衍庸等[23]采用甲烷菌、己酸菌二元發(fā)酵技術(shù)培養(yǎng)窖泥時(shí)，結(jié)果表明兩菌具有互利共生的關(guān)系，在培泥反應(yīng)中，兩株菌的數(shù)量都有所增加。目前，利用己酸菌培窖的微生物技術(shù)已經(jīng)在全國(guó)范圍內(nèi)推廣[24]，而瀘州老窖酒曲試驗(yàn)結(jié)果表明，利用窖泥甲烷菌與己酸菌二元發(fā)酵能夠提高酒體中己酸乙酯的含量[25]，若以酒體中己酸乙酯含量180 mg/100 mL計(jì)，其優(yōu)質(zhì)品率可達(dá)到總出酒量的80.9%?？梢?jiàn)，在白酒釀造體系中，厭氧微生物能有效提高白酒質(zhì)量，提高總出酒量的優(yōu)質(zhì)率。喬宗偉等[26]為了比較準(zhǔn)確地把握濃香型白酒發(fā)酵過(guò)程中酒醅微生物區(qū)系的多樣性及消長(zhǎng)規(guī)律，以全興酒廠正常生產(chǎn)窖池為試驗(yàn)窖，采用特制取樣器跟蹤發(fā)酵過(guò)程取樣，對(duì)窖池酒醅中不同空間位置的微生物區(qū)系進(jìn)行了動(dòng)態(tài)分析，初步弄清了濃香型白酒窖池酒醅不同層面、不同區(qū)域微生物數(shù)量的分布及變化趨勢(shì)，并通過(guò)形態(tài)、生理學(xué)特性的分析比較以及16S rDNA、18S rDNA序列分析等，對(duì)發(fā)酵過(guò)程中主要微生物類群進(jìn)行了分類鑒定。

侯小歌等[27]以河南宋河白酒發(fā)酵30 d的糟醅為實(shí)驗(yàn)材料，通過(guò)富集培養(yǎng)及稀釋涂布法分離厭氧及兼性厭氧菌，以菌落計(jì)數(shù)法確定最佳樣品稀釋度和適宜的厭氧菌培養(yǎng)方法，并采用形態(tài)學(xué)和生理生化特性進(jìn)行種屬的初步鑒定。結(jié)果表明：厭氧及兼性厭氧菌分離適宜稀釋度為10-3，最佳培養(yǎng)方法為抽真空培養(yǎng)法，共分離到5株己酸菌、6株丁酸菌、2株甲烷菌、6株乳酸菌。丁酸菌、己酸菌和乳酸菌革蘭氏染色均為陽(yáng)性，甲烷菌為革蘭氏陰性菌。丁酸菌和己酸菌分別歸梭菌屬（Clostridium）和芽孢桿菌屬（Bacillus），甲烷菌為假單胞菌屬（Pseudomonas），乳酸菌為芽孢乳桿菌屬（Sporolactobacillus）。王莉等[28]通過(guò)對(duì)醬香型白酒發(fā)酵窖池中不同時(shí)間的窖底泥及環(huán)境土樣中的微生物區(qū)系構(gòu)成進(jìn)行了測(cè)序分析，擴(kuò)增樣本中細(xì)菌16S rDNA的v6區(qū)并采用Illumina高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行深度測(cè)序。結(jié)果表明，醬香型白酒廠周邊土壤中的微生物多樣性極其豐富，相比窖底泥中的微生物組成更加復(fù)雜。在土壤馴化成窖底泥的過(guò)程中，微生物的復(fù)雜度逐漸降低，隨著窖底泥的不斷馴化，乳桿菌科（Lactobacillaceae）、梭菌科（Clostridiaceae）和瘤胃茵科（Ruminococcaceae）等厭氧微生物逐漸成為主要優(yōu)勢(shì)種群。另外，從窖泥底分離純化得到的菌株腸球菌科（Enterococcaceae）也是白酒釀造過(guò)程中酒醅中常見(jiàn)的微生物組分[29]，由此可見(jiàn)，在醬香型白酒酒醅發(fā)酵過(guò)程中，酒醅與窖底泥中的微生物進(jìn)行相互滲透和作用。

3 總結(jié)與展望

本文對(duì)目前主要的厭氧細(xì)菌的分離培養(yǎng)方法和在白酒釀造體系中厭氧微生物的研究進(jìn)行了簡(jiǎn)單的概述，對(duì)幾種厭氧微生物的培養(yǎng)方法進(jìn)行比較，結(jié)果顯示：自動(dòng)厭氧手套箱操作簡(jiǎn)單，分離效果最佳，更加有利于厭氧菌的分離純化。通過(guò)對(duì)白酒釀造體系中厭氧微生物的研究，其中主要是厭氧細(xì)菌，包括產(chǎn)己酸菌、產(chǎn)甲烷菌，產(chǎn)乳酸菌等菌屬對(duì)白酒產(chǎn)香產(chǎn)氣有很大的影響，深入研究其產(chǎn)香產(chǎn)氣的機(jī)制是很有必要的，但由于各種環(huán)境的限制，由于厭氧微生物的分離和純種培養(yǎng)的困難，研究厭氧微生物的技術(shù)和方法進(jìn)展又相當(dāng)緩慢。目前，在白酒釀造過(guò)程中，厭氧微生物的研究還處于傳統(tǒng)初級(jí)階段，要想深入了解白酒的代謝機(jī)理以及厭氧微生物在白酒釀造過(guò)程中的作用，還需結(jié)合現(xiàn)代高新生物技術(shù)[30]。例如利用氣質(zhì)聯(lián)用法對(duì)白酒酒醅中厭氧微生物代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析，測(cè)出代謝產(chǎn)物的組分以及各組分的含量，利用高通量分析，可以很好地了解酒醅中厭氧微生物的變化規(guī)律，對(duì)功能微生物的篩選與鑒定和改善白酒的風(fēng)味有很大的意義。

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