王龍梓(淄博職業(yè)學(xué)院藥學(xué)系，山東　淄博　255314)

大豆異黃酮抗氧化作用與腦缺血防治

王龍梓
(淄博職業(yè)學(xué)院藥學(xué)系，山東淄博255314)

〔關(guān)鍵詞〕大豆異黃酮;雌激素;氧化應(yīng)激;超氧化物歧化酶(SOD) ;腦缺血

第一作者:王龍梓(1976-)，男，醫(yī)學(xué)碩士，講師，醫(yī)師，主要從事心腦血管藥理學(xué)研究。

大豆異黃酮(SI)主要活性成分有染料木黃酮(GEN)，大豆黃素(DAI)，黃豆黃素(GLY)等，大部分與糖結(jié)合以糖苷形式存在。大量研究顯示，SI對人類有多種益處:調(diào)節(jié)血脂從而降低冠心病發(fā)生風(fēng)險，防治骨質(zhì)疏松，防治惡性腫瘤及神經(jīng)保護(hù)作用等〔1，2〕。SI能夠與雌激素受體(ER)結(jié)合，具有弱的雌激素活性，被稱為植物雌激素。近年來發(fā)現(xiàn)DAI的體內(nèi)代謝產(chǎn)物雌馬酚的親和力和雌激素樣生物活性均較DAI強(qiáng)，受到學(xué)者的關(guān)注〔3〕。目前，SI作為保健食品已用于女性更年期疾病如絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松等。氧化損傷是腦缺血損傷的關(guān)鍵因素，而SI的抗氧化作用是SI產(chǎn)生腦缺血損傷保護(hù)作用的主要因素。SI在腦缺血損傷中可發(fā)揮直接抗氧化作用抑制過氧化物的產(chǎn)生;也可發(fā)揮間接抗氧化作用抑制促氧化酶如還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶(NOX)的活性，增加抗氧化酶如超氧化物歧化酶(SOD)的活性等。本文對SI的抗氧化作用特點(diǎn)及其通過抗氧化產(chǎn)生腦缺血保護(hù)作用及機(jī)制的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1　SI的抗氧化作用

Oh等〔4〕給予去卵巢雌性SD大鼠喂養(yǎng)SI 12 w，同時給予或不給予運(yùn)動鍛煉。12 w后發(fā)現(xiàn)不管是否給予大鼠運(yùn)動鍛煉，給予SI均能明顯增強(qiáng)血漿三價鐵還原能力(FRAP)，增加血漿谷胱甘肽(GSH)含量。提示SI對絕經(jīng)后的氧化應(yīng)激具有防治作用。有學(xué)者〔5〕檢測了SI在人體的抗氧化作用: SI添加劑80 mg/d給予9個絕經(jīng)后婦女和13個年輕婦女6個月，然后停止應(yīng)用14個月。允許受試者消費(fèi)他們正常的食品。分別于開始研究后2、4、6個月和停止應(yīng)用后的第8個月和第14個月采集血樣，檢測血漿GEN和DAI濃度，總抗氧化能力，氧化應(yīng)激標(biāo)記等。開始研究后第4個月的統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，在包括絕經(jīng)婦女和年輕婦女在內(nèi)的受試者中SI血漿濃度明顯升高，血漿總抗氧化能力明顯增強(qiáng)，氧化應(yīng)激標(biāo)記如紅細(xì)胞膜流動性和紅細(xì)胞O-β-乙酰氨基葡萄糖苷酶(OGA)活性增強(qiáng)，淋巴細(xì)胞DNA的氧化破壞明顯降低。以后恢復(fù)到基礎(chǔ)水平。DNA的破壞和血漿SI水平呈明顯的負(fù)相關(guān)。研究結(jié)果顯示SI添加劑對抗女性體內(nèi)氧化應(yīng)激的有效作用，提示消費(fèi)大豆食品對人類健康的益處部分與SI的抗氧化作用有關(guān)〔5〕。SI的抗氧化作用不僅表現(xiàn)在雌性個體。Barbosa等〔6〕將含SI的大豆蛋白，不含SI的大豆蛋白分組喂養(yǎng)Wistar雄性大鼠，劑量為SI每天1 mg/ 200 g體重，SI各組濃度相同。此方式喂養(yǎng)大鼠30 d后檢測大鼠血和組織器官抗氧化能力發(fā)現(xiàn): SI和大豆蛋白均能增強(qiáng)SOD活性，僅SI而不是大豆蛋白降低血漿硫巴比妥酸反應(yīng)物(TBARS)水平，增強(qiáng)血漿抗氧化能力，增強(qiáng)紅細(xì)胞GSH過氧化物酶(GSH-Px)活性。

體外研究亦顯示SI有效的抗氧化作用及復(fù)雜的抗氧化作用機(jī)制。大豆中提取的異黃酮類物質(zhì)可通過增強(qiáng)一氧化氮(NO)合酶的活性，抑制過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(ECV304)的氧化損傷〔7〕。Xu等〔8〕體外實(shí)驗(yàn)研究顯示，GEN和DAI可抑制H2O2誘導(dǎo)的ECV304損傷，這種保護(hù)作用可被ERβ拮抗劑阻斷;同時，GEN和DAI也抑制低糖條件下氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖，抑制調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡基因Bcl-2的表達(dá)可阻斷這種作用;而且，應(yīng)用渥曼青霉素抑制磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)和Rho/A/Rho激酶通路可改變GEN和DAI維持培養(yǎng)細(xì)胞氧化應(yīng)激下存活的作用。上述研究〔7，8〕提示SI可通過調(diào)節(jié)ERβ、Bcl-2/Bax的基因表達(dá)、調(diào)節(jié)細(xì)胞生存信號等多種途徑保護(hù)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷。

2　SI通過抗氧化作用保護(hù)腦缺血損傷

2.1X腦缺血損傷與氧化應(yīng)激大量研究〔9～11〕提示腦缺血損傷為主要的幾個關(guān)鍵病理因素相互作用的結(jié)果，包括氧化應(yīng)激，鈣離子失平衡，線粒體功能異常，炎癥等因素。腦缺血和再灌注后，氧自由基大量生成，氧化應(yīng)激在腦缺血損傷中起關(guān)鍵作用。幾種氧自由基和其衍生物在腦卒中后產(chǎn)生，包括超氧陰離子和羥自由基(·OH)等。氧自由基能與NO反應(yīng)產(chǎn)生過氧化物(ONOO－)，這是一種強(qiáng)的氧自由基，導(dǎo)致蛋白質(zhì)硝化和功能失常。上述氧化劑除了氧化大分子導(dǎo)致細(xì)胞損傷，也參與細(xì)胞生存死亡途徑和導(dǎo)致線粒體功能失?！?〕。氧自由基的產(chǎn)量能通過體內(nèi)氫化水電乙叉基(HEt)檢測來評價。細(xì)胞內(nèi)HEt被氧化和轉(zhuǎn)換為乙叉基(Et)，在生理?xiàng)l件下，Et信號被作為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)微粒檢測，體現(xiàn)了線粒體內(nèi)的產(chǎn)量。在局灶性缺血區(qū)再灌注4 h后，神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)一種散開模式的Et熒光信號提示廣泛和大量的在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)產(chǎn)生〔10〕。而且，全腦缺血使大鼠表現(xiàn)為遲發(fā)型細(xì)胞死亡的海馬CA1區(qū) Et信號增強(qiáng)。提示氧化應(yīng)激在腦缺血遲發(fā)型神經(jīng)細(xì)胞死亡中起重要作用〔11〕。

2.2SI通過抗氧化作用保護(hù)腦缺血損傷研究資料顯示，多酚類化合物可通過抗氧化作用，抑制腦缺血后損傷和線粒體功能失常導(dǎo)致的腦水腫和細(xì)胞腫脹，從而產(chǎn)生腦保護(hù)作用〔12〕。血清雌激素劑量在生理水平時具有腦保護(hù)作用，間接抗氧化作用是雌激素發(fā)揮腦缺血保護(hù)作用的主要機(jī)制之一〔13〕。SI可以通過抗氧化機(jī)制產(chǎn)生腦缺血保護(hù)作用。

研究顯示，雌性SD大鼠去卵巢后喂養(yǎng)含SI大豆食品2 w，行持續(xù)性局灶性腦缺血24 h后大鼠腦梗死面積明顯縮小，提示含SI大豆食品長期預(yù)防性給予可保護(hù)腦缺血損傷〔14〕。藥理干預(yù)研究中，Wistar大鼠飼養(yǎng)時均為無大豆飲食，給予大鼠腦缺血90 min，后實(shí)現(xiàn)再灌注。于腦缺血再灌注30 min后給予GEN每天1 mg/kg腹腔注射。再灌注3 d后wistar大鼠腦梗死面積與對照組相比明顯減小，而WKY大鼠和自發(fā)高血壓大鼠腦梗死面積與對照組相比無明顯減小。提示SI的主要活性成分GEN治療給藥具有腦缺血保護(hù)作用，但依賴于實(shí)驗(yàn)動物的品系; GEN治療給藥可減輕Wistar大鼠缺血腦組織實(shí)現(xiàn)血管再通后的腦損傷〔15〕。

SI的抗氧化作用機(jī)制既有抑制氧化應(yīng)激的直接抗氧化作用，也有通過影響體內(nèi)抗氧化物質(zhì)如SOD和體內(nèi)促氧化物質(zhì)如NOX的間接抗氧化作用。有學(xué)者〔16〕系統(tǒng)地研究了SI通過抗氧化作用保護(hù)大鼠腦缺血損傷。雄性和雌性去卵巢SD大鼠去SI飲食1 w后，在異氟烷麻醉下行局灶性腦缺血90 min，實(shí)現(xiàn)再灌注后，分組飼養(yǎng)去SI食物或添加GEN 500/10^(500 ppm)食物或添加雌馬酚(250 ppm)食物2 w。再灌注24 h確定氧化應(yīng)激指標(biāo)，再灌注3 d后評價腦損傷情況。結(jié)果顯示，與無SI組相比，食用GEN和DAI的雄性和雌性大鼠腦梗死體積明顯減小，雌雄無明顯差別。與Barbosa等〔6〕研究不同的是，GEN不能明顯降低血漿巴比妥酸反應(yīng)物(TBARS)水平。但雌馬酚治療組血漿TBARS水平明顯降低，提示雌馬酚比GEN抗氧化作用強(qiáng)。GEN和雌馬酚均能明顯降低雌性去卵巢大鼠腦組織過氧化物水平和NOX活性，而且之間無明顯差別。雌馬酚和GEN促進(jìn)大鼠腦組織兩種抗氧化基因的表達(dá)。分別是DNA修復(fù)基因Ercc2和保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷的一種雌激素敏感酶Nqo1。雌馬酚和GEN對腦組織NOX活性影響與對NOX復(fù)合體gp91phox和p22亞基蛋白表達(dá)的影響無關(guān)。提示雌馬酚和GEN主要影響腦組織NOX的活性。雖然雌馬酚和GEN對腦組織SOD蛋白水平和過氧化物酶水平未見影響，但沒有測定SOD的活性〔16〕。Barbosa等〔6〕研究顯示，SI長期應(yīng)用可增強(qiáng)大鼠血漿SOD活性。雄性糖尿病大鼠給予4 w，每天1 mg/kg的GEN后使主動脈SOD活性得到一定程度恢復(fù)〔17〕。

體外實(shí)驗(yàn)研究檢測了3種大豆植物雌激素GEN，DAI和DAI的代謝物雌馬酚對受到體外缺血樣損傷的幼年大鼠前腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞的作用，劑量為SI在人類血循環(huán)中的有效濃度(0.1～1 μmol/L)。預(yù)先給予3種植物雌激素均抑制暴露于谷氨酸毒性或鈣離子依賴的三磷酸腺苷(ATP)酶抑制劑毒胡蘿卜素之下的細(xì)胞釋放乳酸脫氫酶(LDH)。事先用3種植物雌激素治療的暴露于組織缺氧或氧剝奪損傷(OGD)的細(xì)胞通過ER依賴機(jī)制抑制細(xì)胞死亡。雖然OGD導(dǎo)致多種模式的細(xì)胞死亡，但是通過檢查和Caspase-3活性來看，大豆植物雌激素可抑制此模型的細(xì)胞凋亡。此外，阻斷PI3K抑制GEN和DAI的保護(hù)作用，絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)抑制GEN依賴的神經(jīng)保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示飲食水平的大豆植物雌激素能發(fā)揮雌激素樣神經(jīng)保護(hù)作用〔18〕。

2.3SI促進(jìn)腦缺血損傷的可能性SI和雌激素均具有明顯的抗氧化作用，但雌激素長期應(yīng)用副作用大，缺乏孕激素時會明顯增加癌癥的發(fā)生風(fēng)險。研究顯示，血清雌激素水平在生理劑量時具有腦保護(hù)作用，而超生理水平促進(jìn)腦缺血損傷〔13〕。與此相似，大豆植物雌激素長期應(yīng)用也有促進(jìn)腦缺血損傷的可能。如DAI的代謝產(chǎn)物雌馬酚雖然比GEN和DAI抗氧化作用強(qiáng)，但是最近研究提示小鼠長期食用雌馬酚產(chǎn)生促進(jìn)氧化的作用〔19〕。雖然低劑量雌馬酚喂養(yǎng)小鼠3 w后可抑制過氧化物的產(chǎn)生，增加H2O2酶和SOD的活性產(chǎn)生抗氧化作用，但是高劑量雌馬酚長期應(yīng)用增加TBARS水平，過氧化氫酶(CAT)和SOD的活性受到抑制，通過促進(jìn)p53基因的表達(dá)促進(jìn)小鼠腦細(xì)胞凋亡。提示高劑量雌馬酚尤其是長期應(yīng)用通過促進(jìn)氧化的作用損傷小鼠腦組織。SI的其他活性形式如GEN等則未見體內(nèi)長期應(yīng)用產(chǎn)生促氧化作用的研究。有研究顯示大鼠長期單獨(dú)應(yīng)用GEN時，體內(nèi)5和10 μmol/L濃度的SI水平幾乎無副作用，但無人體長期安全性證據(jù)〔20〕。需進(jìn)一步研究SI的慢性毒性考察其促進(jìn)腦缺血損傷的可能性。

3　SI通過抗氧化機(jī)制產(chǎn)生腦缺血保護(hù)作用研究前景

氧化損傷是腦缺血和再灌注損傷后級聯(lián)損傷反應(yīng)的關(guān)鍵因素，SI的腦缺血保護(hù)作用與其抗氧化作用密切相關(guān)，而SI的抗氧化作用與其增強(qiáng)抗氧化酶SOD的活性，抑制NOX的活性密切相關(guān)。雖然氧化應(yīng)激是腦缺血再關(guān)注損傷的主要原因之一已經(jīng)被前期研究證實(shí)，但是抗氧化劑實(shí)現(xiàn)對臨床缺血腦卒中病人的有效治療似乎仍然遙遙無期。應(yīng)用于腦缺血保護(hù)的藥物如抗氧化劑臨床試驗(yàn)均宣告失敗。腦缺血病理生理機(jī)制的研究進(jìn)展較大，但治療手段很有限。僅僅重組組織纖溶酶原激活物的溶栓治療作為有效的治療方法。其治療時間窗有限，且有出血風(fēng)險和潛在的缺血再灌注損傷風(fēng)險〔21〕。筆者認(rèn)為，發(fā)現(xiàn)臨床有效的腦缺血保護(hù)藥不僅應(yīng)該繼續(xù)深入探索腦缺血過程的病理生理機(jī)制，而且應(yīng)該進(jìn)一步改進(jìn)腦缺血保護(hù)藥臨床療效評價方法。此外，應(yīng)該繼續(xù)深入探討腦缺血保護(hù)藥治療的時間窗來評價此類藥物的有效性和作用特點(diǎn)。

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〔2013-12-30修回〕

(編輯杜娟)

〔中圖分類號〕R743

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2015) 15-4385-03;

doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2015.05.131