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iTRAQ技術(shù)在阿爾茨海默病早期診斷中的應(yīng)用

曾九江田立兵白帥魏楚蓉毛慕華羅友根

(井岡山大學(xué)神經(jīng)退行性疾病與衰老研究中心，江西吉安343000)

〔關(guān)鍵詞〕阿爾茨海默??；iTRAQ；蛋白組學(xué)；早期診斷

第一作者：曾九江(1991-)，男，主要從事神經(jīng)損傷修復(fù)研究。

迄今為止，阿爾茨海默病(AD)的病因和發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前尚無(wú)有效治療措施，所以AD的早期診斷顯得尤為重要。結(jié)合多維液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜分析，相對(duì)和絕對(duì)定量的等量異位標(biāo)簽技術(shù)(iTRAQ)現(xiàn)已成為蛋白組學(xué)定量研究的主要工具之一。它能夠精確篩選和鑒定病理狀態(tài)下差異表達(dá)蛋白并分析其功能，從而明確疾病的病因和發(fā)病機(jī)制并對(duì)疾病做出早期診斷。本文就iTRAQ技術(shù)在AD早期診斷中的應(yīng)用作一概述。

1iTRAQ技術(shù)原理

iTRAQ試劑為能與氨基酸N端及賴氨酸側(cè)鏈連接的胺標(biāo)記同種元素，由4種分子量均為145 D的等量異位標(biāo)簽分子組成。 標(biāo)簽分子分別由質(zhì)量為 114、115、116、117 Da的報(bào)道基團(tuán)、質(zhì)量為31、30、29、28 D的質(zhì)量平衡臂和一個(gè)相同的多肽反應(yīng)基團(tuán)組成〔1〕。報(bào)告部分 有4種(114～117)，因此iTRAQ可同時(shí)標(biāo)記4組樣品，現(xiàn)在該試劑已經(jīng)發(fā)展到可以同時(shí)標(biāo)記8種不同蛋白質(zhì)樣品,分析能力明顯提高。平衡部分可保證iTRAQ標(biāo)記的同一肽段的質(zhì)荷比相同。肽反應(yīng)部分能與肽N端及賴氨酸側(cè)鏈發(fā)生共價(jià)連接，可標(biāo)記所有酶解肽段。

iTRAQ標(biāo)記和分析過(guò)程：將4種蛋白質(zhì)樣品分別進(jìn)行還原和烷基化，經(jīng)胰蛋白酶水解后，分別用4種不同的iTRAQ試劑進(jìn)行標(biāo)記，將所有樣品混合，然后經(jīng)非在線或在線的液相分離，并用串聯(lián)質(zhì)譜方法對(duì)在第一級(jí)質(zhì)譜檢測(cè)到的前體離子進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離，產(chǎn)物離子通過(guò)第二級(jí)質(zhì)譜進(jìn)行分析。第二級(jí)質(zhì)譜可同時(shí)檢測(cè)到質(zhì)量相差1 D的114、115、116和117 D 4種報(bào)道離子和被標(biāo)記多肽肽鍵斷裂產(chǎn)生的離子串。前者代表不同樣品中相同多肽的豐度，而后者可通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)的搜索確定蛋白質(zhì)前體的身份。在其上4 種報(bào)告基團(tuán)通過(guò)平衡基團(tuán)與反應(yīng)基團(tuán)相連，幾乎可以標(biāo)記所有蛋白質(zhì)〔2,3〕。在質(zhì)譜圖中，任何一種iTRAQ試劑標(biāo)記的不同樣本中的同一蛋白質(zhì)表現(xiàn)為相同的質(zhì)荷比，而且信號(hào)離子表現(xiàn)為不同質(zhì)荷比(114～117)的峰，并根據(jù)波峰的高度及面積，獲取蛋白質(zhì)的定量信息。

2iTRAQ技術(shù)在AD早期診斷中的應(yīng)用

2.1定量分析神經(jīng)細(xì)絲神經(jīng)細(xì)絲(NF)是神經(jīng)細(xì)胞骨架之一，由三種多肽亞基組成：NF-L(73 kD)、NF-M(145 kD)、 NF-H(200 kD)。神經(jīng)骨架蛋白的異常磷酸化是AD的一個(gè)早期的病理生理特征。iTRAQ分析報(bào)道，與正常腦相比，AD腦中NF-M Ser-783位點(diǎn)的磷酸化水平顯著升高。另外，用磷酸化的Ser-680 和Ser-685來(lái)標(biāo)示人類NF-M的肽殘基，與正常腦相比，iTRAQ試劑標(biāo)記在AD腦上的相對(duì)強(qiáng)度達(dá)到高峰值，表明AD腦中NF-M的Ser-685位點(diǎn)磷酸化水平也升高〔4〕。采用iTRAQ技術(shù)對(duì)AD腦NF-H磷酸肽進(jìn)行鑒定和定量分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AD腦中NF-H有10個(gè)KSP位點(diǎn)存在高水平的磷酸化(磷酸化水平為對(duì)照組的2.31～8.01倍)，并通過(guò)iTRAQ分析認(rèn)為細(xì)胞周期素依賴蛋白激酶5(Cdk5)是AD腦中NF-H高度磷酸化的主要激酶〔4〕?？傊?，iTRAQ分析顯示AD腦中的神經(jīng)纖絲NF-M 和 NF-H比正常腦磷酸化水平更高，這是首次運(yùn)用定量技術(shù)來(lái)鑒定多部位高度磷酸化的蛋白。這種對(duì)NF-M 和 NF-H磷酸化部位進(jìn)行iTRAQ定量分析對(duì)AD早期診斷具有重要意義。

2.2定量分析Aβ前體蛋白APPβ淀粉樣蛋白(Aβ)是淀粉樣蛋白前體(APP)經(jīng)蛋白水解酶水解后的產(chǎn)物，是AD腦內(nèi)主要病理標(biāo)志性蛋白之一。有研究報(bào)道，3×Tg AD鼠存在Aβ沉積，并采用iTRAQ方法定量分析了16月齡的3×Tg AD鼠腦內(nèi)蛋白的差異表達(dá)，發(fā)現(xiàn)APP突變基因高度表達(dá)〔5〕。也有研究認(rèn)為，APP突變的轉(zhuǎn)基因模式動(dòng)物在Aβ形成前，已經(jīng)有許多蛋白的表達(dá)發(fā)生變化，大部分蛋白在學(xué)習(xí)和記憶中有重要的作用，表明APP基因突變使其它許多蛋白表達(dá)發(fā)生變化，最終導(dǎo)致老年斑的形成，認(rèn)知功能下降〔6〕。這些數(shù)據(jù)為AD的早期診斷提供強(qiáng)有力的證據(jù)。

2.3定量分析N-糖蛋白N-糖蛋白的糖基化與AD密切相關(guān)。iTRAQ技術(shù)結(jié)合18O穩(wěn)定同位素鑒定N-糖基化位點(diǎn)，定量糖基化肽類和非糖基化的肽類，并且在目標(biāo)糖蛋白中獲得N-糖基化位點(diǎn)比率。再用H216O和H218O分別標(biāo)記經(jīng)過(guò)肽-N-聚糖酶F催化的N-糖基化位點(diǎn)，結(jié)果肽裂解碎片使標(biāo)記的肽和相應(yīng)的蛋白得以鑒定，并通過(guò)測(cè)量標(biāo)記的肽碎片產(chǎn)生的報(bào)告離子的強(qiáng)度來(lái)使肽相對(duì)定量化從而判斷各種蛋白的來(lái)源。數(shù)據(jù)顯示，AD腦中報(bào)告離子的強(qiáng)度比正常的強(qiáng)，說(shuō)明異常糖基化水平的上調(diào)與AD緊密聯(lián)系〔7〕。這些數(shù)據(jù)說(shuō)明，iTRAQ可以通過(guò)定量分析蛋白質(zhì)的糖基化水平，在AD的早期診斷中發(fā)揮其作用。

2.4定量分析線粒體膜蛋白能量代謝是機(jī)體維持正常生理功能所必須的，倘若代謝失衡，將導(dǎo)致疾病發(fā)生。腦是一高耗能組織，對(duì)血流量和氧的需求較高。毫無(wú)疑問(wèn)，AD的發(fā)病與能量代謝息息相關(guān)。采用iTRAQ技術(shù)結(jié)合質(zhì)譜法定量分析3×Tg AD鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)24種蛋白表達(dá)出現(xiàn)明顯失調(diào)，其中三分之一屬于與氧化磷酸化系統(tǒng)復(fù)合體I和IV密切相關(guān)的線粒體蛋白〔8〕。另外有數(shù)據(jù)證明，AD腦內(nèi)存在著氧化磷酸化系統(tǒng)復(fù)合酶Ⅰ和Ⅳ的下調(diào)，而線粒體膜蛋白的異常表達(dá)引起線粒體能量代謝障礙，從而使神經(jīng)元變性和壞死，誘發(fā)AD〔9〕。

2.5定量分析其他AD相關(guān)蛋白采用B104神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系建立一種體外神經(jīng)元缺血缺氧模型，利用以iTRAQ為基礎(chǔ)的鳥(niǎo)槍法蛋白定量技術(shù)分析AD相關(guān)蛋白(如ω-谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、14-3-3δ/ζ等)的表達(dá)水平，從而對(duì)AD做出早期診斷。研究發(fā)現(xiàn)，ω-谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶這一與AD有關(guān)的多功能酶表達(dá)水平出現(xiàn)下調(diào)，并在抗氧化應(yīng)激中發(fā)揮重要保護(hù)作用〔10〕。14-3-3δ/ζ特異蛋白是一種高豐度的銜接蛋白，被稱為AD遺傳網(wǎng)絡(luò)的中心樞紐〔11〕。這些研究成果均表明iTRAQ技術(shù)在AD的早期診斷中將大有作為。

3展望

iTRAQ 是近年來(lái)開(kāi)發(fā)的一種新的蛋白定量技術(shù)，它為AD的深入研究提供了一個(gè)強(qiáng)有力的平臺(tái)，也在一定程度上為AD的早期診斷打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。iTRAQ技術(shù)雖然優(yōu)于其他同位素標(biāo)記的蛋白定量研究技術(shù)，但尚存在一些棘手的問(wèn)題，如iTRAQ 標(biāo)記操作時(shí)需要胰蛋白酶消化，這就導(dǎo)致結(jié)果可能受到樣品處理誤差或消化程度不同的影響；iTRAQ試劑易受污染；iTRAQ試劑標(biāo)記蛋白量有限制以及價(jià)格昂貴等〔12～14〕。隨著質(zhì)譜技術(shù)、軟件分析系統(tǒng)的發(fā)展，iTRAQ技術(shù)有望成為日后定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究的核心技術(shù)。

4參考文獻(xiàn)

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〔2015-03-11修回〕

(編輯李相軍)

《中國(guó)老年學(xué)雜志》被國(guó)內(nèi)數(shù)家數(shù)據(jù)庫(kù)、檢索性期刊檢索機(jī)構(gòu)收錄情況

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通訊作者：羅友根(1970-)，男，博士，副教授，主要從事阿爾茨海默病病因、機(jī)制及防治研究。

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.31360238)；江西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.20132BAB205020，20142BAB205030)；井岡山大學(xué)2014年度大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃資助項(xiàng)目(No.2014029)

〔中圖分類號(hào)〕Q421

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2015)22-6616-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.22.145