?

人臍帶間充質(zhì)干細胞移植治療血管性癡呆的可能性

何燕王俊魏云鴻金醒昉

(昆明醫(yī)科大學(xué)附屬延安醫(yī)院，云南昆明650051)

關(guān)鍵詞〔〕間充質(zhì)干細胞;細胞移植;血管性癡呆

第一作者：何燕(1980-)，女，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事心腦血管病研究。

我國老年性癡呆中血管性癡呆(VD)占第二位，在腦卒中患者中VD的患病率為12%～36.3%〔1〕。間充質(zhì)干細胞(MSCs)存在于全身結(jié)締組織和器官間質(zhì)中。人臍帶MSCs(HUC-MSCs)成功克服了骨髓MSCs含量低、受年齡影響大等諸多限制，而且具有來源廣泛、免疫原性低等優(yōu)點。HUC-MSCs在組織工程、神經(jīng)系統(tǒng)、肝臟疾病、心血管系統(tǒng)、免疫疾病、腫瘤疾病等方面取得了巨大的進展。已有多項研究表明，體外培養(yǎng)的HUC-MSCs可向神經(jīng)細胞方向分化〔2，3〕，且HUC-MSCs移植治療腦卒中的動物實驗研究也取得了可喜的成果〔4〕。因此，HUC-MSCs有可能用于VD的治療。

1VD的發(fā)病機制

VD是由腦血管因素導(dǎo)致腦組織損害引起的癡呆綜合征，其確切發(fā)病機制尚不明確。目前較為明確的機制有如下幾個方面：①膽堿能傳導(dǎo)通路受損：VD的記憶功能障礙與中樞膽堿能系統(tǒng)有著必然的聯(lián)系，大鼠缺血再灌注后乙酰膽堿(Ach)濃度下降，同時給予擬膽堿能藥物能改善學(xué)習(xí)記憶功能。許多研究證明，記憶突觸即為膽堿能突觸，膽堿能神經(jīng)通路本身即參與構(gòu)成記憶痕跡隔閡-海馬的傳導(dǎo)通路與空間識別、工作記憶有關(guān)，大細胞基底核-大腦皮質(zhì)的傳導(dǎo)通路與學(xué)習(xí)過程的調(diào)制、參照記憶有關(guān)。VD大鼠腦組織Ach合成酶(ACHE)活性明顯升高〔5〕。膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(CHAT)免疫組化表明，海馬CA1區(qū)CHAT免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元和纖維數(shù)量明顯減少，與大鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙程度呈正相關(guān)。這些部位的損傷可導(dǎo)致皮質(zhì)、海馬及大細胞基底核細胞萎縮，膽堿能傳導(dǎo)通路受損，從而引起膽堿能缺陷和學(xué)習(xí)記憶功能障礙〔6，7〕。②神經(jīng)細胞凋亡：現(xiàn)有研究表明，在腦組織缺血早期，由于腦缺血過度激活谷氨酸受體，導(dǎo)致細胞內(nèi)的Ca2+超載、自由基數(shù)目增加、細胞內(nèi)的線粒體損傷受損，出現(xiàn)神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞的凋亡〔8〕。尤其是海馬CA1區(qū)神經(jīng)元和纖維數(shù)量明顯減少可嚴重影響記憶功能。③氧自由基：腦缺血再灌注的急性期可產(chǎn)生大量的自由基，自由基的連鎖反應(yīng)主要攻擊灰質(zhì)的神經(jīng)元等富含脂質(zhì)的腦細胞，引起磷脂破壞降解從而發(fā)生變性失能，使細胞膜的通透性大大增加，從而發(fā)生了細胞的毒性水腫，興奮性遞質(zhì)釋放。自由基由于連鎖反應(yīng)而發(fā)生的急速蓄積，進一步攻擊其他細胞的生物膜結(jié)構(gòu)，造成神經(jīng)細胞的壞死，半暗帶區(qū)進一步惡化，梗死范圍迅速擴展。④炎性機制：急性腦缺血后，在繼發(fā)性神經(jīng)損傷中起主要作用的是炎性反應(yīng)，其中白細胞介素(IL)-1β和炎性細胞因子可引起缺血再灌注中炎性反應(yīng)，其局部表達最為突出。腦缺血和再灌注時，內(nèi)皮細胞、神經(jīng)元等在局部被激活，通過釋放兩種關(guān)鍵的炎性因子腫瘤細胞壞死因子(TNF)-α和IL-1β觸發(fā)炎癥反應(yīng)，引起其他細胞因子與炎性代謝產(chǎn)物一起促使白細胞遷移至組織損傷區(qū)，導(dǎo)致血管再閉塞，引發(fā)“無再流”現(xiàn)象白細胞還可以產(chǎn)生蛋白水解酶和其他效應(yīng)分子，引起神經(jīng)元的直接損傷，提示炎性機制可能在VD的發(fā)病機制中起重要作用。

由此可見，VD既有腦血管病的病理學(xué)改變和膽堿能神經(jīng)元的壞死，又有神經(jīng)生化機制的受損，而目前認為，干細胞一方面可以在受損的組織中生成新的功能細胞，另一方面，還可以分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子(NT)、免疫調(diào)節(jié)因子及營養(yǎng)分子以對損傷組織進行修復(fù)。

2UC-MSCs治療VD的優(yōu)勢

Romanov等〔9〕從臍靜脈內(nèi)皮下層成功分離出MSCs。研究表明，臍帶中富含造血、間充質(zhì)及內(nèi)皮等多種干/祖細胞，其中MSCs可來源于臍帶華爾通膠，臍血管周圍，臍靜脈血管內(nèi)皮下和臍血(新鮮臍血單核細胞中可分離20%～50%的MSCs)〔10〕。HUC-MSCs的優(yōu)勢在于：①臍帶是胎兒的附屬物，取材方便，來源廣泛，易于收集、冷凍、保存；②從臍帶華爾通膠中提取的MSC取材方便，相對純凈，致瘤性和病毒、細菌污染可能性均較骨髓干細胞低；③不表達或低表達免疫排斥相關(guān)標(biāo)記，免疫原性低，是一類免疫缺陷細胞，異體移植無免疫排斥反應(yīng)或反應(yīng)較弱，在臨床應(yīng)用上還避免了胚胎干細胞的倫理爭議；④UC-MSCs含量豐富，原代培養(yǎng)即可獲取大量細胞，其分化潛能介于胚胎干細胞和成體干細胞之間，既不會發(fā)生自發(fā)分化又不會無限增殖而形成畸胎瘤，又易于分化為 3個胚層衍生的多種成熟細胞；⑤與骨髓MSCs相比，不會隨著傳代次數(shù)增加和機體年齡增長導(dǎo)致增殖能力和分化能力降低〔11〕。因此，HUC-MSCs已被當(dāng)做是臨床和科研工作中MSCs的一個更佳來源。

3UC-MSCs向神經(jīng)干細胞的轉(zhuǎn)化

UC-MSCs具有較強的可塑性，能發(fā)育成多種不同的細胞，成為人MSCs的重要來源。實驗〔2〕證明，HUC-MSCs可以誘導(dǎo)為神經(jīng)細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞。Mitchell等〔12〕先以堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)預(yù)處理過夜，再以多種化學(xué)誘導(dǎo)劑進行誘導(dǎo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大部分細胞轉(zhuǎn)變成神經(jīng)元樣細胞，并高水平地表達神經(jīng)元標(biāo)志物β-Ⅲ型微管蛋白和神經(jīng)微絲。Fu等〔2〕以神經(jīng)元條件培養(yǎng)基進行誘導(dǎo)，第3天時可見細胞發(fā)生形態(tài)學(xué)改變并開始表達神經(jīng)元抗核抗體和神經(jīng)微絲；第6天時開始表達紅藻氨酸鹽受體和谷氨酸脫羧酶；第9～12天時神經(jīng)微絲的表達水平進一步上升并可檢測到谷氨酸誘發(fā)的內(nèi)向電流，表明這時的細胞已轉(zhuǎn)化為成熟神經(jīng)元。Ding等〔3〕發(fā)現(xiàn)以bFGF、β-巰基乙醇、NT-3、神經(jīng)生長因子和腦源性NT(BDNF)對克隆擴增的UC-MSCs進行誘導(dǎo)后約60%的細胞可表達微管相關(guān)蛋白-2，32%表達膠質(zhì)纖維酸性蛋白。Koh等〔13〕對將UC-MSCs進行體外誘導(dǎo)后發(fā)現(xiàn)，約有(77.4±17.8)%的細胞表達神經(jīng)元特異性標(biāo)志物如β-Ⅲ型微管蛋白、酪氨酸激酶受體、神經(jīng)元核抗原和神經(jīng)微絲-M，而表達星形細胞標(biāo)志物膠質(zhì)纖維酸性蛋白和少突膠質(zhì)細胞標(biāo)志物半乳糖腦苷脂的細胞數(shù)目則不足10%。Karahuseyinoglu等〔14〕則認為人臍帶基質(zhì)細胞中的扁平、粗大的1型細胞對神經(jīng)誘導(dǎo)分化方案基本無反應(yīng)，而成纖維細胞樣的2型細胞可被誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元。此外，研究表明，HUC-MSCs不僅可分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞，還可分化為特定類型的神經(jīng)元細胞。Fu等〔15〕以神經(jīng)元條件培養(yǎng)基和成纖維細胞生長因子(FGF)-8成功地將HUC-MSCs誘導(dǎo)為表達酪氨酸羥化酶并分泌多巴胺的多巴胺能神經(jīng)元。此外，Weiss等〔16〕還成功地將其誘導(dǎo)為表達酪氨酸羥化酶的膽堿能神經(jīng)元。

4UC-MSCs治療VD的可能性

腦血管病、頸部血管病變、血流動力學(xué)改變等多種病因引起大腦長期低灌注，導(dǎo)致大腦神經(jīng)細胞物質(zhì)和能量代謝紊亂，促使腦部神經(jīng)元發(fā)生不同程度的損傷或丟失或者由于出血導(dǎo)致的腦實質(zhì)損傷而引起認知功能損害是VD發(fā)生的核心機制。但HUC-MSCs治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病尚處于起步階段，動物實驗證明移植HUC-MSCs有助于促進創(chuàng)傷性腦損傷后的早期功能恢復(fù)〔17〕，可改善帕金森病、脊髓損傷、腦卒中后遺癥〔18〕。目前國內(nèi)外尚未見到其治療VD的臨床研究。HUC-MSCs在VD患者腦內(nèi)能否存活并分化為膽堿能神經(jīng)元或增加膽堿能神經(jīng)元的含量及改善局部缺血腦組織的血供，成為眾多學(xué)者關(guān)注的問題。通過以上研究已經(jīng)證明，HUC-MSCs內(nèi)含有可向神經(jīng)細胞方向分化的干細胞，并且其用于缺血性腦血管病動脈模型的治療也被證明有效。因此，HUC-MSCs可能成為治療VD的新方法，其治療VD的可能機制包括以下幾個方面：

4.1細胞替代作用UC-MSCs具有多向分化潛能，可向神經(jīng)細胞系多種細胞轉(zhuǎn)化，具有神經(jīng)干細胞或神經(jīng)前體細胞特性。在合適的誘導(dǎo)條件下，神經(jīng)干細胞或神經(jīng)前體細胞可分化為膽堿能細胞〔16〕。如果將UC-MSCs移植到VD患者腦內(nèi)，部分細胞有可能向膽堿能細胞分化，從而發(fā)揮細胞替代治療作用，改善VD患者的癥狀。

4.2神經(jīng)營養(yǎng)支持和抑制凋亡作用神經(jīng)損傷后，在神經(jīng)元與靶細胞建立正確的聯(lián)系過程中，保持神經(jīng)元的存活及軸突的延伸，必須獲得營養(yǎng)的支持才能得以實現(xiàn)。而NT在神經(jīng)生長中起著重要的營養(yǎng)支持作用。實驗研究證實HUC-MSCs具有豐富的分泌功能，可分泌多種促血管因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子。Lin等〔19〕發(fā)現(xiàn)，移植于腦缺血模型的MSCs能產(chǎn)生bFGF等NT，促進動物的神經(jīng)功能恢復(fù)和減輕缺血再灌注損傷。何遠東等〔20〕通過流式細胞儀檢測HUC-MSCs的神經(jīng)營養(yǎng)因子譜，發(fā)現(xiàn)與神經(jīng)營養(yǎng)相關(guān)的因子BDNF、表皮生長因子(EGF)、膠源NT(GDNF)、NT-3、血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)、胰島素樣生長因子(IGF)-1、NT-4在HUC-MSCs中均有表達，進一步驗證了HUC-MSCs通過分泌NT治療神經(jīng)損傷的作用。此外，HUC-MSCs還有抑制神經(jīng)細胞凋亡的作用，袁源等〔17〕實驗發(fā)現(xiàn)，將HUC-MSCs移植后1～3 w，動物神經(jīng)功能評分較對照組明顯改善；4 w后，各組動物神經(jīng)功能評分均恢復(fù)正常。免疫組織化學(xué)檢測表明少部分移植細胞表達神經(jīng)元特異性烯醇化酶，膠質(zhì)纖維酸性蛋白。與對照組相比，移植組損傷區(qū)VEGF表達明顯增加，凋亡細胞減少，促進神經(jīng)功能恢復(fù)。

4.3 促進血管生成，改善局部血流的供應(yīng)HUC-MSCs移植到腦缺血大鼠損傷局部，發(fā)現(xiàn)干細胞廣泛參與到血管壁中，參與血管的形成，免疫學(xué)染色還發(fā)現(xiàn)，部分MSCs表達血管內(nèi)皮細胞特異性蛋白血管性血友病因子(vWF)〔4〕。MSCs的成血管能力在其他的缺血模型如心梗、下肢缺血中也得到了證實〔21，22〕。此外，MSCs本身可以通過旁分泌作用促進血管的增生，MSCs不僅能分泌VEGF、bFGF、肝細胞生長因子(HGF)等促血管新生的活性因子，還可以分泌血管新生所需要的細胞外基質(zhì)成分如整合素、鈣黏素等，從而參與血管的生成〔23〕。Liao等〔4〕研究還證明了，HUC-MSCs有助于促進腦缺血大鼠損傷神經(jīng)早期功能恢復(fù)，這種治療效果是通過刺激宿主細胞分泌VEGF，增加損傷區(qū)微血管密度來實現(xiàn)的。

4.4抑制炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)作用研究發(fā)現(xiàn)，HUC-MSCs的移植可以減輕損傷后組織的炎癥反應(yīng)，包括抑制白細胞的浸潤和小膠質(zhì)細胞的激活，下調(diào)活性氧簇和炎癥因子的分泌從而減輕神經(jīng)損傷。MSCs在免疫方面具有非常特殊的作用，除了本身低免疫源性外，MSCs還能調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，發(fā)揮免疫抑制和抗炎的作用〔24，25〕。MSCs可以抑制樹突細胞遷移與成熟，使樹突細胞保持在不成熟狀態(tài)或成熟異常；MSC和淋巴細胞混合培養(yǎng)后，可以下調(diào)干擾素(IFN)-γ、IL-2、TNF-α等促炎因子，從而抑制T淋巴細胞的增殖，MSC還可以抑制原始T細胞和記憶T細胞，抑制淋巴細胞生長因子IL-2及其受體的表達、抑制T細胞表面共刺激因子CD80、CD86的表達而使T細胞無能〔26〕。

參考文獻5

1王維治.神經(jīng)病學(xué)〔M〕.第5版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2005：290-1.

2Fu YS，Shih YT，Cheng YC，etal.Transformation of human umbilical mesenchymal cells into neurons in vitro〔J〕.J Biom Sci，2004;11(5)：652-60.

3Ding DC，Shyu WC，Chiang MF，etal.Enhancement of neuroplasticity though upregulation of beta 1-integrin in human umbilical cord-derived stromal cell implanted stroke model〔J〕.Neurobiol Dis，2007;27(3)：339-53.

4Liao W，Xie J，Zhong J，etal.Therapeutic effect of human umbilical cord multipotent mesenchymal stromal cells in a rat model of stroke〔J〕.Transplantation，2009;87(3)：350-9.

5吳啟偉.血管性癡呆的基礎(chǔ)性研究進展〔J〕.中華醫(yī)學(xué)研究雜志，2005;5(10)：1009-11.

6范文輝，劉之榮.血管性癡呆的動物模型及其膽堿能機制研究〔J〕.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2000;22(4)：314-6.

7Erkinjuntti T，Roman G.Emerging therapies for vascular dementia and vascular cognitive impairment〔J〕.Stroke，2004;35(4)：1010-7.

8羅永堅，藺心敬，李呂力，等.血管性癡呆模型大鼠海馬神經(jīng)元凋亡和病理改變的實驗研究〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2008;28(18)：1788-90.

9Romanov YA，Svintsitskaya VA，Smirnov VN.Searching for alternative sources of postnatal human mesenchymal stem cell：candidate MSC-like cells from umbilical cord〔J〕.Stem Cell，2003;21(1)：105-10.

10Sarugaser R，Lickorish D，Baksh D，etal.Human umbilical cord perivascular(HUCPV)cells：a source of mesenchymal progenitors〔J〕.Stem Cell，2005;23(2)：220-9.

11Troyer DL，Weiss ML.Wharton's jelly-derived cells are a primitive stromal cell population〔J〕.Stem Cell，2008;26(3)：591-9.

12Mitchell KE，Weiss ML，Mitchefl BM.Matrix cells from Wharton's jelly form neurons and glia〔J〕.Stem Cell，2003;21(1)：50-60.

13Koh SH，Kim KS，Choi MR.Implantation of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells as a neuroprotective therapy for ischemic stroke in rats〔J〕.Br Res，2008;10，1229：233-8.

14Karahuseyinoglu S，Kocaefe C，Balci Detal.Functional structure of adipocytes differentiated from human umbilical cord stroma-derived stem cell〔J〕.Stem Cell，2008;26(3)：682-91.

15Fu YS，Cheng YC，Lin MY，etal.Conversion of human umbilical cord mesenchymal stem cells in Wharton′s jelly to dopaminergic neurons in vitro：potential therapeutic application for Parkinsonism〔J〕.Stem Cell，2009;24(1)：115-24.

16Weiss ML，Anderson C，Modieetty S.Immune properties of human umbilical cord Wharton's jelly-derived cells〔J〕.Stem Cell，2008;26(11)：2865-74.

17袁源，楊樹源，張建寧.人臍帶間充質(zhì)干細胞移植治療大鼠創(chuàng)傷性腦損傷〔J〕.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2011;15(45)：8424-8.

18Dalous J，Larghero J，Baud O.Transplantation of umbilical cord-derived mesenchymal stem cells a novel strategy to protect the central nervous system：technical aspects，preclinical studies，and clinical perspectives〔J〕.Pediatr Res，2012;71(4 Pt 2)：482-90.

19Lin TN，Te J，Lee M，etal.Induction of basic fibroblast growth factor(bFGF)expression following focal cerebral ischemia〔J〕.Br Res Mol Br Res，1997;49(1-2)：255-65.

20何遠東，王玉，彭江.人臍帶間充質(zhì)干細胞中神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達〔J〕.中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志，2012;11(5)：438-42.

21Wu KH，Zhou B，Yu CT，etal.Therapeutic potential of human umbilical cord derived stem cells in a rat myocardial infarction model〔J〕.Ann Thoracic Surg，2011;83(4)：1491-8.

22Ishikane S，Ohnishi S，Yamahara K，etal.Allogeneic injection of fetal membrane-derived mesenchymal stem cells induces therapeutic angiogenesis in a rat model of hind limb ischemia〔J〕.Stem Cells，2008;26(10)：2625-33.

23Honczarenko M，Le Y，Swierkowski M，etal.Human bone marrow stromal cells express a distinct set of biologically functional chemokine receptors〔J〕.Stem Cells，2006;24(4)：1030-41.

24Nauta AJ，F(xiàn)ibbe WE.Immunomodulatory properties of mesenchymal stromal cells〔J〕.Blood，2007;110(10)：3499-506.

25Ren G，Zhang L，Zhao X，etal.Mesenchymal stem cell-mediated immunosuppression occurs via concerted action of chemokines and nitric oxide〔J〕.Cell Stem Cell，2012;2(2)：141-50.

26Suzdaltseva YG，Burunova VV，Vakhrushev IV，etal.In vitro comparison of immunological properties of cultured human mesenchymal cells from various sources〔J〕.Bull Exp Biol Med，2008;145(2)：228-31.

〔2015-01-15修回〕

(編輯杜娟)

通訊作者：金醒昉(1962-)，女，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事老年病研究。

基金項目：云南省科技廳-昆明醫(yī)科大學(xué)應(yīng)用基礎(chǔ)研究聯(lián)合專項基金資助(No.2011FB233)

中圖分類號〔〕R741.05〔

文獻標(biāo)識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)23-6945-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.23.138