侵襲性曲霉菌感染的診斷方法及臨床應(yīng)用

王立朋秦榛1夏云

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，重慶400016)

關(guān)鍵詞〔〕G試驗(yàn)；GM試驗(yàn)；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；核酸序列依賴擴(kuò)增；曲霉菌

中圖分類號(hào)〔〕R44〔

基金項(xiàng)目：國(guó)家臨床重點(diǎn)專科建設(shè)項(xiàng)目經(jīng)費(fèi)資助〔財(cái)社2010(305)號(hào)〕

通訊作者：夏云(1966-)，男，主任技師，碩士生導(dǎo)師，主要從事感染性疾病的分子診斷研究。

1山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科

第一作者：王立朋(1989-)，男，檢驗(yàn)技師，碩士，主要從事感染性疾病的分子診斷研究。

近年來(lái)由于腫瘤化療，造血干細(xì)胞移植術(shù)、實(shí)體器官移植術(shù)后應(yīng)用免疫抑制劑及糖皮質(zhì)激素等藥物〔1〕，臨床上出現(xiàn)越來(lái)越多的免疫力低下的老年病人并使得侵襲性曲霉菌感染的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，免疫力低下的老年病人發(fā)生侵襲性曲霉菌感染后的死亡率也一直居高不下。在侵襲性真菌感染中，曲霉菌所導(dǎo)致的感染占了很大的比例，2000 ～ 2008年美國(guó)一腫瘤中心發(fā)生侵襲性曲霉菌感染的比例達(dá)58%〔2，3〕。抽樣調(diào)查顯示，空氣中存在的孢子0.1%～22%為曲霉屬孢子〔4〕。曲霉菌感染可以導(dǎo)致人類多種疾病，比如侵襲性曲霉病，侵襲性肺曲霉病，過(guò)敏性支氣管曲霉病，過(guò)敏性真菌鼻竇炎等。除了曲霉病以外，曲霉菌還可以導(dǎo)致其他多種疾病，比如曲霉腫、鼻竇炎、過(guò)敏性支氣管曲霉病等〔5〕。研究表明，某些曲霉病也可發(fā)生于一些與上述高危因素侵襲性曲霉菌感染的診斷方法及臨床應(yīng)用無(wú)關(guān)的病人中，如肺曲霉病可繼發(fā)于慢性阻塞性肺病(COPD)、非真菌性肺炎等〔6〕。早期精確的診斷結(jié)果是及早開(kāi)展抗霉菌治療的前提。而及時(shí)、正確的抗霉菌治療無(wú)疑能夠顯著改善臨床預(yù)后，降低死亡率。

1物理診斷

這種傳統(tǒng)的診斷方法主要是通過(guò)問(wèn)診的手段獲取病人的臨床癥狀及體征。但由于侵襲性曲霉菌感染所帶來(lái)的臨床癥狀和體征缺乏特異性，并不能同其他非真菌病原體所導(dǎo)致的感染區(qū)分開(kāi)來(lái)。并且一些重病患者往往不能或是難以準(zhǔn)確地表達(dá)出自身的感受。根據(jù)一些臨床〔6〕經(jīng)驗(yàn)，長(zhǎng)期耐抗生素性的發(fā)熱、咳嗽并伴有肋膜炎樣的疼痛對(duì)于侵襲性曲霉菌感染具有提示作用。

2影像學(xué)診斷

影像學(xué)對(duì)于侵襲性曲霉菌感染的診斷最具有價(jià)值的是高分辨率CT掃描檢查，尤其是對(duì)于肺曲霉病的診斷具有較高的參考價(jià)值。侵襲性肺曲霉病CT首次檢查的早期多表現(xiàn)為大小不等的結(jié)節(jié)，7～14 d時(shí)，結(jié)節(jié)病變的數(shù)量和大小均表現(xiàn)出增加趨勢(shì)〔7〕。肺部發(fā)生曲霉菌感染早期的CT掃描亦可出現(xiàn)光環(huán)征，隨著感染病程的發(fā)展，晚期可以出現(xiàn)新月征。CT檢查的缺點(diǎn)在于光環(huán)征等特征性影像出現(xiàn)的時(shí)間比較短暫，75%的光環(huán)征1 w以內(nèi)就會(huì)消失〔2〕。而且并非所有曲霉菌感染病患都能出現(xiàn)特征性的CT影像；此外出現(xiàn)這兩種影像也有可能是由于其他病原微生物感染亦或是一些非感染病因引起的〔8〕。故對(duì)于CT掃描影像的提示價(jià)值應(yīng)當(dāng)慎重評(píng)估。

3實(shí)驗(yàn)診斷

3.1顯微鏡檢查顯微鏡檢查主要包括標(biāo)本直接顯微鏡檢查和組織病理學(xué)檢查,都是以形態(tài)學(xué)特點(diǎn)為基礎(chǔ)來(lái)對(duì)病原微生物進(jìn)行診斷。曲霉菌鏡檢呈現(xiàn)玻璃樣透明的菌絲，但是曲霉菌菌絲結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的特異性并不突出，其他種類相似的真菌如青霉菌亦可呈現(xiàn)類似的鏡下特點(diǎn)。另一方面，組織病理學(xué)檢查報(bào)告中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)曲霉樣形態(tài)學(xué)特點(diǎn)等描述性的診斷結(jié)果，這對(duì)于顯微鏡下形態(tài)學(xué)特點(diǎn)與曲霉菌類似但又不是曲霉菌的一些病原微生物的診斷帶來(lái)困難。由于鑒別診斷難以進(jìn)行，誤診的出現(xiàn)幾乎不可避免。若是發(fā)生誤診的兩種病原微生物的治療方案相差較大，就會(huì)嚴(yán)重影響治療效果，從而進(jìn)一步導(dǎo)致預(yù)后不良。此外，檢查者的主觀因素也有可能對(duì)診斷結(jié)論產(chǎn)生影響。

3.2病原微生物培養(yǎng)標(biāo)本病原微生物的培養(yǎng)結(jié)果或是組織病理學(xué)診斷結(jié)論依然是侵襲性曲霉菌感染確診的“金標(biāo)準(zhǔn)”，這是曲霉菌感染的診斷基礎(chǔ)〔3〕。曲霉菌的培養(yǎng)適用于各種標(biāo)本類型并且目前已經(jīng)成熟的應(yīng)用于臨床，尤其是來(lái)源于無(wú)菌部位的標(biāo)本培養(yǎng)結(jié)果陽(yáng)性具有確診價(jià)值。但是曲霉菌的培養(yǎng)與普通的細(xì)菌培養(yǎng)相比往往耗時(shí)更長(zhǎng)，而且敏感性并不夠高，侵襲性曲霉菌感染早期培養(yǎng)結(jié)果通常是陰性。此外，由于曲霉菌是機(jī)會(huì)致病菌，從有菌區(qū)獲取的陽(yáng)性培養(yǎng)結(jié)果并不能明確是由于定植的正常菌群或是侵襲性感染所致。

近年來(lái)，培養(yǎng)技術(shù)的改進(jìn)能夠獲取比以前準(zhǔn)確性更好的結(jié)果，并且在一定程度上可以縮短培養(yǎng)時(shí)間。但是，獲取培養(yǎng)或是組織病理檢查的標(biāo)本往往要通過(guò)侵入性的檢查手段，而另一方面侵襲性曲霉菌感染通常繼發(fā)于免疫功能低下病人，這類病人很大一部分病情較重，此時(shí)侵入性檢查往往不被接受，這在一定程度上又限制了這兩種傳統(tǒng)方法的應(yīng)用。

3.3臨床免疫學(xué)診斷臨床免疫學(xué)診斷主要包括曲霉菌抗原檢測(cè)及機(jī)體產(chǎn)生的抗體檢測(cè)。由于侵襲性曲霉菌感染者多伴有免疫缺陷，免疫功能受到削弱，機(jī)體可能并不能進(jìn)行有效的免疫應(yīng)答產(chǎn)生抗體，抗體的檢測(cè)對(duì)侵襲性曲霉菌感染的診斷意義不大，尤其是對(duì)于中性粒細(xì)胞減少病人的診斷價(jià)值更小，故臨床應(yīng)用的重點(diǎn)在于曲霉菌抗原檢測(cè)。曲霉菌抗原檢測(cè)方法主要是(1，3)-β-D-葡聚糖(G)試驗(yàn)和血清半乳甘露聚糖(GM)試驗(yàn)。

3.3.1G試驗(yàn)G試驗(yàn)檢測(cè)的是真菌細(xì)胞壁的成分：(1,3)-β-D-葡聚糖。人體吞噬細(xì)胞吞噬真菌后能夠持續(xù)釋放該物質(zhì)使得其在體液中的含量增高。(1,3)-β-D-葡聚糖可特異性激活鱟變形細(xì)胞裂解物中的G因子，引起裂解物凝固，故稱G試驗(yàn)。該試驗(yàn)適用于曲霉菌感染的診斷，但是并不能明確菌種。G試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性是歐洲癌癥研究和治療組織/侵襲性真菌感染協(xié)作組和美國(guó)國(guó)立變態(tài)反應(yīng)和感染病研究院真菌研究組(EORTC/MSG)的一個(gè)真菌感染間接標(biāo)準(zhǔn)，并且已經(jīng)被美國(guó)食品藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)用于血清樣本的檢測(cè)。G試驗(yàn)?zāi)軌驒z測(cè)出0.5 ng/ml的(1,3)-β-D-葡聚糖，對(duì)于急性髓性白血病(AML)和骨髓增生異常綜合征(MDS)病人來(lái)說(shuō)有很高的準(zhǔn)確度(敏感度97%，特異度93%)。G試驗(yàn)的關(guān)鍵點(diǎn)在于標(biāo)準(zhǔn)化操作及臨界值的確定〔7〕。G試驗(yàn)的缺點(diǎn)在于假陽(yáng)性的存在。假陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)的原因主要包括以下幾個(gè)方面：血液透析和腹膜透析過(guò)程中使用纖維素膜；病人治療過(guò)程中輸入白蛋白、免疫球蛋白及凝血因子；病人服用β內(nèi)酰胺類抗生素；鏈球菌引起的敗血癥；外科手術(shù)中使用的棉紗等。在評(píng)估G試驗(yàn)陽(yáng)性結(jié)果時(shí)，應(yīng)把可能導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果的因素排除在外。

3.3.2GM試驗(yàn)主要用于侵襲性曲霉菌感染的診斷。發(fā)生曲霉菌感染時(shí)，菌絲生長(zhǎng)時(shí)半乳甘露聚糖可以從菌絲頂端釋放入血，且釋放量與血液中的菌量呈正比，故可以間接反映感染程度。研究顯示，循環(huán)性半乳甘露聚糖敏感性在70%～90%，陽(yáng)性測(cè)試結(jié)果的特異性也在70%～90%〔9〕。另有報(bào)道顯示，血清半乳甘露聚糖的檢測(cè)比臨床癥狀或是影像學(xué)檢查異常的出現(xiàn)早5～8 d。結(jié)合很有可能發(fā)生侵襲性霉菌感染的病例，分析的特異度為89%～93%，敏感度61%～71%。陽(yáng)性預(yù)測(cè)值較低而陰性預(yù)測(cè)值很高，故可用于排除侵襲性霉菌感染發(fā)生的可能〔10〕。值得注意的是，血清半乳甘露聚糖連續(xù)兩次結(jié)果陽(yáng)性比單獨(dú)一次的結(jié)果陽(yáng)性具有更大的臨床意義，連續(xù)兩次結(jié)果陽(yáng)性作為診斷標(biāo)準(zhǔn)能提供更好的準(zhǔn)確度。為了提高診斷結(jié)果的可靠性，可以對(duì)曲霉菌感染的高危病患進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測(cè)。

與G試驗(yàn)相似，GM試驗(yàn)亦有假陽(yáng)性結(jié)果的存在。引起假陽(yáng)性結(jié)果的原因主要包括病人服用哌拉西林-他唑巴坦；病人食用的谷類食物含有GM抗原；定植的曲霉菌由于種種原因進(jìn)入血液循環(huán)。在對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行評(píng)估時(shí)，應(yīng)將上述因素排除在外。總體來(lái)說(shuō)，臨床免疫學(xué)診斷方法在排除影響結(jié)果的因素后，具有較大的應(yīng)用價(jià)值。除血清外，其他標(biāo)本類型如支氣管肺泡灌洗液等也可用于檢測(cè)。對(duì)于呼吸系統(tǒng)可能存在的曲霉菌感染，支氣管肺泡灌洗液的抗原檢查要比血清抗原檢查及支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本分離培養(yǎng)、活組織病理切片檢查的敏感性更高〔11〕。

3.4分子生物學(xué)診斷聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)分子生物學(xué)技術(shù)用于曲霉菌感染的診斷主要是及以PCR為基礎(chǔ)的檢測(cè)體系。PCR檢測(cè)體系的靶點(diǎn)主要包括曲霉菌一些基因位點(diǎn)的保守序列或是線粒體DNA片段。首先將標(biāo)本中可能存在的曲霉菌DNA提取出來(lái)，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR將其擴(kuò)增得出初始標(biāo)本中的曲霉菌DNA拷貝數(shù)或是利用傳統(tǒng)PCR將其擴(kuò)增后，利用其他分析方法對(duì)擴(kuò)增后產(chǎn)物進(jìn)行分析，從而得到初始標(biāo)本中的曲霉菌的量和種類等相關(guān)信息。

PCR檢測(cè)曲霉菌感染近年來(lái)得到很多研究支持，Suarez等〔12〕應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)以編碼曲霉菌28S rRNA的多拷貝基因片段為靶點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)熒光定量PCR比半乳甘露聚糖檢測(cè)具有更好的靈敏度，實(shí)現(xiàn)了曲霉菌感染的進(jìn)一步的提前診斷；O'Sullivan等〔13〕應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，以編碼ITS1與ITS2保守序列及5.8 S rRNA的基因片段為靶點(diǎn)，對(duì)支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，獲得了比培養(yǎng)更好的靈敏度；Schabereiter-Gurtner等〔14〕以ITS2區(qū)域?yàn)榘悬c(diǎn)，設(shè)計(jì)具有屬特異性的引物并結(jié)合有種特異性的探針，以PCR擴(kuò)增過(guò)程中出現(xiàn)的特征性的最高融解溫度，將臨床標(biāo)本最常分離到的曲霉菌屬和念珠菌屬中的11個(gè)種群篩選并區(qū)別開(kāi)來(lái)。

通過(guò)PCR發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果比CT掃描平均早1 w，比組織病理學(xué)檢查早2～3 w〔10〕。以PCR為基礎(chǔ)的檢測(cè)體系用于檢測(cè)曲霉菌感染的靈敏度由于靶點(diǎn)、標(biāo)本類型的不同可能會(huì)有所差異，但報(bào)道顯示總體的靈敏度較高：Francesconi等〔15〕應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，并與半乳甘露聚糖檢測(cè)以及培養(yǎng)的方法進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)前兩者均比培養(yǎng)的方法更加敏感；Scotter等〔16〕報(bào)道實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)曲霉菌的檢測(cè)下限為100 CFU，將PCR與酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)技術(shù)結(jié)合以后，檢測(cè)下限可以提高到10 CFU；Bansod等〔17〕用PCR以18 S rRNA基因?yàn)榘悬c(diǎn)檢測(cè)煙曲霉菌的檢測(cè)下限達(dá)10 fg。此外，PCR檢測(cè)的特異度很高，Rantakokko-Jalava等〔18〕研究顯示PCR用于檢測(cè)煙曲霉菌的特異度可達(dá)93%。

雖然基于PCR技術(shù)的診斷方法靈敏度和特異度均比較理想，但其缺點(diǎn)在于污染問(wèn)題和假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)。由于空氣中可能存在的霉菌孢子可能會(huì)對(duì)反應(yīng)體系帶來(lái)污染，因此操作時(shí)應(yīng)在超凈臺(tái)或是生物安全柜中進(jìn)行。此外，此類方法仍處于研發(fā)階段，尚未出臺(tái)達(dá)成共識(shí)的標(biāo)準(zhǔn)化操作規(guī)程，進(jìn)入臨床應(yīng)用仍需大量研究的數(shù)據(jù)及標(biāo)準(zhǔn)操作流程。

近年來(lái)，除PCR以外，其他可用于侵襲性曲霉菌感染診斷的新方法不斷涌現(xiàn)。如Zhao等〔19〕運(yùn)用核酸序列依賴擴(kuò)增(NASBA)結(jié)合分子信標(biāo)(MB)檢測(cè)支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本中的曲霉菌感染，檢測(cè)下限<0.1 CFU。核酸序列依賴擴(kuò)增技術(shù)相比較PCR最大的不同點(diǎn)在于整個(gè)擴(kuò)增過(guò)程在恒溫下進(jìn)行，不需要高溫變性步驟，即使有外來(lái)的DNA也不會(huì)發(fā)生解鏈，再加上引物的特異識(shí)別，可有效避免PCR所存在的污染及假陽(yáng)性問(wèn)題；結(jié)合分子信標(biāo)構(gòu)成檢測(cè)體系，由于分子信標(biāo)也具有一定的特異識(shí)別能力，故使得特異性得以進(jìn)一步的提高，具有較好的臨床應(yīng)用前景。

此外，熒光原位雜交(FISH)可以特異性地檢測(cè)出組織石蠟切片中的曲霉菌，設(shè)計(jì)不同菌屬探針進(jìn)行靶DNA雜交可以快速檢測(cè)各種臨床標(biāo)本中的真菌感染,根據(jù)不同種屬的曲霉菌設(shè)計(jì)出靶DNA序列特異性探針，明確曲霉菌種，以期早期病原學(xué)診斷侵襲性真菌感染(IFI)，達(dá)到搶先治療的目的〔20〕。Hsiao等〔21〕應(yīng)用DNA芯片用于診斷霉菌感染的診斷，靈敏度和特異度分別達(dá)到98.3%和98.1%。斑點(diǎn)雜交法具有快速敏感特異的優(yōu)點(diǎn)對(duì)煙曲霉菌感染的快速診斷亦有重要意義〔22〕。結(jié)合目前的臨床實(shí)際狀況，臨床醫(yī)師懷疑免疫低下老年病人發(fā)生侵襲性曲霉菌感染時(shí)，應(yīng)當(dāng)及時(shí)多部位采集標(biāo)本，并且盡可能采集多種類型的標(biāo)本(如血液、支氣管肺泡灌洗液、胸腹水等)送檢，并且對(duì)于曲霉菌感染的高危病患可以1 w內(nèi)多次送檢以實(shí)現(xiàn)對(duì)于感染狀況的連續(xù)監(jiān)測(cè)。如若條件允許，可以再輔以高分辨率CT掃描檢查(尤其是胸腔可能發(fā)生的真菌感染)。聯(lián)合多種方法可盡早實(shí)現(xiàn)對(duì)于曲霉菌感染的準(zhǔn)確診斷。對(duì)于免疫力低下病人可在合適的時(shí)機(jī)采用預(yù)防性的抗曲霉菌藥物，在明確的診斷結(jié)果反饋以后再對(duì)感染的治療策略進(jìn)行調(diào)整。

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〔2013-09-05修回〕

(編輯安冉冉/張慧)