石慶珊 彭永根 安洪偉

（國藥集團(tuán)貴州血液制品有限公司，貴州黔東南556011）

0 引言

75%乙醇是較為常用的消毒液，試驗(yàn)室通常用75%乙醇消毒桌面、臺面以及潔凈區(qū)房間，甚至用75%乙醇浸泡帶菌物品。按照2017年版消毒技術(shù)規(guī)范（2.1.1.9真菌殺滅試驗(yàn)）規(guī)定，消毒劑對黑曲霉菌的殺滅對數(shù)值≥5.00。黑曲霉菌（Aspergillus niger）是一種常見真菌，早在2002年版消毒技術(shù)規(guī)范關(guān)于試驗(yàn)指標(biāo)菌的規(guī)定中，黑曲霉菌被定為致病性真菌的代表。鑒于黑曲霉菌培養(yǎng)的特殊性，一些研究者對其進(jìn)行了檢測，并做了有關(guān)消毒劑對黑曲霉菌殺滅效果的評價(jià)，但對一定時(shí)間內(nèi)消毒劑對黑曲霉菌的殺滅效果評價(jià)報(bào)道較少。

為了解75%乙醇消毒液在一定時(shí)間內(nèi)對黑曲霉菌的消毒效果，本文對黑曲霉菌菌懸液進(jìn)行了殺菌試驗(yàn)[1]，以研究75%乙醇對黑曲霉菌的殺滅效果。

1 儀器與材料

1.1 儀器

電熱恒溫培養(yǎng)箱，寧波東南儀器有限公司；生物安全柜，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.2 材料

沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，招遠(yuǎn)拓普生物工程有限公司；黑曲霉菌[CMCC（F）98003]，招遠(yuǎn)拓普生物工程有限公司；0.9%無菌氯化鈉溶液，貴州科倫藥業(yè)有限公司；吐溫-80，天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；75%乙醇，國藥集團(tuán)貴州血液制品有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 黑曲霉菌孢子懸液的制備

首先，取黑曲霉菌[CMCC（F）98003]凍干菌種管，用麥芽浸膏肉湯培養(yǎng)基進(jìn)行增菌培養(yǎng)，再經(jīng)過沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板劃線進(jìn)行分離培養(yǎng)，選取單個(gè)典型菌落接種于沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上，在23℃條件下培養(yǎng)7天，得到新鮮培養(yǎng)物。然后，取5 mL 0.9%無菌氯化鈉溶液洗下斜面上的孢子，將孢子洗脫。最后，采用無菌注射器吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用0.9%無菌氯化鈉溶液制備成每1 mL含黑曲霉菌孢子數(shù)100～200 CFU的孢子懸液備用。

2.2 中和劑的制備

取含20 g/L吐溫-80的胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）作為中和劑，能起到有效中和75%乙醇對試驗(yàn)菌的殘留作用。

2.3 75%乙醇對黑曲霉菌的殺菌試驗(yàn)

將75%乙醇分裝成0mL、2 mL、4 mL、6mL、8mL、10 mL的消毒液（陽性對照用0.9%無菌氯化鈉溶液），置于室溫下備用；取分別2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL的黑曲霉菌孢子懸液（黑曲霉菌孢子數(shù)100～200 CFU）于5支無菌試管中。然后，用不同體積的75%乙醇分別對5個(gè)不同體積的孢子懸液進(jìn)行作用至預(yù)定時(shí)間，取0.5 mL菌藥混合液加入至4.5 mL的中和劑（含20 g/L吐溫-80的TSB）管內(nèi)。中和作用10 min，取樣品液接種進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)，計(jì)算殺滅對數(shù)值。該試驗(yàn)重復(fù)3次。

3 試驗(yàn)結(jié)果

上述試驗(yàn)重復(fù)做3次，試驗(yàn)結(jié)果及分析分別如表1、表2、表3所示。

在表1中，0 mL的75%乙醇為菌懸液對照組。黑曲霉菌菌懸液與75%乙醇等體積混合后，每組數(shù)據(jù)顯示黑曲霉菌均已被大幅度殺滅。2 mL黑曲霉菌菌懸液與75%乙醇等體積混合30 min后有1個(gè)黑曲霉菌菌落生長；4 mL黑曲霉菌菌懸液與75%乙醇等體積混合35 min后有1個(gè)黑曲霉菌菌落生長；6 mL黑曲霉菌菌懸液與75%乙醇等體積混合30 min后有2個(gè)黑曲霉菌菌落生長；8 mL黑曲霉菌菌懸液與75%乙醇等體積混合20 min后有1個(gè)黑曲霉菌菌落生長，8 mL黑曲霉菌菌懸液與75%乙醇等體積混合30 min后有1個(gè)黑曲霉菌菌落生長；10 mL黑曲霉菌菌懸液與75%乙醇等體積混合30 min后有1個(gè)黑曲霉菌菌落生長，10 mL黑曲霉菌菌懸液與75%乙醇等體積混合35 min后有1個(gè)黑曲霉菌菌落生長。上述5組試驗(yàn)生長的菌落數(shù)均小于菌懸液對照組的2%，生長黑曲霉菌的時(shí)間點(diǎn)不是隨著時(shí)間的變化而變化，大部分的黑曲霉菌已經(jīng)被殺滅，殘留極少的黑曲霉菌在混合液中分布不均勻。因此，在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)都可能會生長黑曲霉菌。另外，35 min內(nèi)黑曲霉菌沒有完全被殺滅，未被消毒液殺滅的菌落平均比值為0.183%。

在表2中，0 mL的75%乙醇為菌懸液對照組。黑曲霉菌菌懸液與75%乙醇等體積混合后，每組數(shù)據(jù)顯示黑曲霉菌均已被大幅度殺滅。4 mL黑曲霉菌菌懸液與75%乙醇等體積混合35 min后有1個(gè)黑曲霉菌菌落生長；6 mL黑曲霉菌菌懸液與75%乙醇等體積混合15 min后有1個(gè)黑曲霉菌菌落生長，6 mL黑曲霉菌菌懸液與75%乙醇等體積混合20 min后有2個(gè)黑曲霉菌菌落生長，6 mL黑曲霉菌菌懸液與75%乙醇等體積混合30 min后有2個(gè)黑曲霉菌菌落生長；8 mL黑曲霉菌菌懸液與75%乙醇等體積混合30 min后有1個(gè)黑曲霉菌菌落生長；10 mL黑曲霉菌菌懸液與75%乙醇等體積混合20 min后有1個(gè)黑曲霉菌菌落生長，10 mL黑曲霉菌菌懸液與75%乙醇等體積混合25 min后有1個(gè)黑曲霉菌菌落生長，10 mL黑曲霉菌菌懸液與75%乙醇等體積混合40 min后有1個(gè)黑曲霉菌菌落生長。上述5組試驗(yàn)生長的菌落數(shù)均小于菌懸液對照組的2%，生長黑曲霉菌的時(shí)間點(diǎn)不是隨著時(shí)間的變化而變化，大部分黑曲霉菌已經(jīng)被殺滅，殘留極少的黑曲霉菌在混合液中分布不均。因此，在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)都可能生長黑曲霉菌。另外，40 min內(nèi)黑曲霉菌沒有完全被殺滅，未被消毒液殺滅的菌落平均比值為0.283%。

表1 75%乙醇對黑曲霉菌殺菌試驗(yàn)的結(jié)果分析（第1次）

表2 75%乙醇對黑曲霉菌殺菌試驗(yàn)的結(jié)果分析（第2次）

在表3中，0 mL的75%乙醇為菌懸液對照組。黑曲霉菌菌懸液與75%乙醇等體積混合后，每組數(shù)據(jù)顯示黑曲霉菌均已被大幅度殺滅。2 mL黑曲霉菌菌懸液與75%乙醇等體積混合30 min后有1個(gè)黑曲霉菌菌落生長；4 mL黑曲霉菌菌懸液與75%乙醇等體積混合20 min后有1個(gè)黑曲霉菌菌落生長，4 mL黑曲霉菌菌懸液與75%乙醇等體積混合25 min后1個(gè)有黑曲霉菌菌落生長，4 mL黑曲霉菌菌懸液與75%乙醇等體積混合35 min后有1個(gè)黑曲霉菌菌落生長；6 mL黑曲霉菌菌懸液與75%乙醇等體積混合25 min后有2個(gè)黑曲霉菌菌落生長；8 mL黑曲霉菌菌懸液與75%乙醇等體積混合20 min后有1個(gè)黑曲霉菌菌落生長。上述5組試驗(yàn)生長菌落數(shù)均小于菌懸液對照組的2%，生長黑曲霉菌的時(shí)間點(diǎn)不是隨著時(shí)間的變化而變化，大部分黑曲霉菌已經(jīng)被殺滅，殘留極少的黑曲霉菌在混合液中分布不均。因此，在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)都可能生長黑曲霉菌。另外，35min內(nèi)黑曲霉菌沒有完全被殺滅，未被消毒液殺滅的菌落平均比值為0.192%。

表3 75%乙醇對黑曲霉菌殺菌試驗(yàn)的結(jié)果分析（第3次）

通過對上述3次試驗(yàn)結(jié)果分析，可得出每次黑曲霉菌未被75%乙醇?xì)绲木淦骄戎?，從而?jì)算出每次已被75%乙醇?xì)绲木淦骄戎?，進(jìn)而算出已被75%乙醇?xì)绲木淇偲骄怠＞C合分析結(jié)果如表4所示。

通過重復(fù)3次的試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，75%乙醇對菌懸液作用40 min內(nèi)，未被75%乙醇?xì)绲木淇偲骄戎禐?.219%。第1次試驗(yàn)結(jié)果已被75%乙醇?xì)绲木淦骄戎禐?9.817%，第2次試驗(yàn)結(jié)果已被75%乙醇?xì)绲木淦骄戎禐?9.717%，第3次試驗(yàn)結(jié)果已被75%乙醇?xì)绲木淦骄戎禐?9.808%，由此可得3次試驗(yàn)已被75%乙醇?xì)绲木淇偲骄戎禐?9.781%。

4 試驗(yàn)討論

本次研究重復(fù)3次試驗(yàn)，3次試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)有一定差距，試驗(yàn)全過程均在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行，需要用的試管、吸管、平皿等器具均通過濕熱滅菌后方可使用，試驗(yàn)前開啟紫外燈對生物安全柜滅菌消毒20 min，消毒完畢待風(fēng)機(jī)運(yùn)行30 min后進(jìn)行試驗(yàn)。3次試驗(yàn)操作人員不變，操作時(shí)間、操作人員的動作幅度以及環(huán)境等因素，會對試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生一定影響。

5 結(jié)語

本研究結(jié)果顯示，75%乙醇消毒液對黑曲霉菌的殺滅能力很強(qiáng)。黑曲霉菌作為第四類病原微生物，通常情況下不會引發(fā)人類疾病，但會對藥品生產(chǎn)檢驗(yàn)和環(huán)境構(gòu)成威脅，75%乙醇消毒液能使黑曲霉菌的蛋白質(zhì)凝固，使其不能形成薄膜，通過酒精持續(xù)向其內(nèi)部滲透并進(jìn)行消毒殺菌，本試驗(yàn)殺滅效果可達(dá)到99.781%。

表4 75%乙醇對黑曲霉菌重復(fù)3次殺菌試驗(yàn)結(jié)果的綜合分析