氯吡格雷對(duì)大鼠肝微粒體細(xì)胞色素P450酶含量及CYP3A4活性的影響

楊光遠(yuǎn)韓梅王明富陳鋒孔繁和張磊藝趙曉輝劉明遠(yuǎn)

(佳木斯大學(xué)，黑龍江佳木斯154007)

摘要〔〕目的探討氯吡格雷對(duì)大鼠肝微粒體細(xì)胞色素P450 (CYP450) 含量及CYP3A4活性的影響。方法以生理鹽水為對(duì)照，對(duì)照組大鼠灌胃給予1 ml生理鹽水，氯吡格雷組大鼠每日灌胃給予6.75 mg/kg的氯吡格雷，連續(xù)7 d，然后測(cè)定大鼠肝微體中CYP450含量及CYP3A4活性。結(jié)果與對(duì)照組比較，氯吡格雷組的肝微粒體CYP450含量無變化( P>0.05)，CYP3A4活性明顯降低 (P<0.01)。結(jié)論氯吡格雷對(duì)CYP450含量無影響，但對(duì)CYP3A4活性有抑制作用。

關(guān)鍵詞〔〕氯吡格雷;CYP450; CYP3A4

中圖分類號(hào)〔〕R969.2〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：黑龍江省教育廳面上項(xiàng)目資助(No.12511571)

通訊作者：劉明遠(yuǎn)(1973-)，女，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事藥物分析及藥物代謝研究。

第一作者：楊光遠(yuǎn)(1975-)，男，副教授，主要從事心血管藥理及藥物相互作用研究。

氯吡格雷是一類具有抗血小板作用的噻吩并吡啶衍生物，需要經(jīng)肝細(xì)胞色素P450酶生物轉(zhuǎn)化為有活性的代謝物方能起作用。催化激活氯吡格雷的肝細(xì)胞色素P450酶主要為CYP3A4，其他肝細(xì)胞色素P450酶如：CYP1A2、CYP2B6、CYP2C9及CYP2C19也參與氯吡格雷的代謝過程〔1〕。藥物對(duì)肝微粒體CYP450酶的作用是藥物間發(fā)生相互作用的重要機(jī)制之一，氯吡格雷與多種藥物聯(lián)用發(fā)生代謝性相互作用的報(bào)道屢見不鮮，如質(zhì)子泵抑制劑〔2〕、降脂藥〔3〕、鈣通道阻滯藥〔4〕及選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑(SSRI)類抗抑郁藥等〔5〕。關(guān)于氯吡格雷口服給藥對(duì)肝微粒體酶的影響，目前尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)旨在探討氯吡格雷對(duì)大鼠肝細(xì)胞色素P450酶含量及肝微粒體中最重要的亞型CYP3A4活性的影響，以考察其是否會(huì)在臨床聯(lián)合用藥時(shí)存在潛在的代謝性相互作用。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物體重200～250 g的Wistar雄性大鼠，佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK-(黑)2013-001)。

1.2試劑與儀器硫酸氫氯吡格雷對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院)；咪達(dá)唑侖(含量>98%，徐州恩華藥業(yè)集團(tuán)有限責(zé)任公司)；1′-羥基咪達(dá)唑侖(含量>98%，Sigma公司)； Agilent 1100高效液相色譜系統(tǒng)(Agilent公司，美國)；QTRAP型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(Applied Biosystem公司，美國)。

1.3方法

1.3.1大鼠給藥方案健康Wistar大鼠18只，雄性，隨機(jī)分成三組，每組6只，各組等體積連續(xù)7 d給予生理鹽水或相應(yīng)藥物。對(duì)照組灌胃給予生理鹽水；氯吡格雷組，灌胃給予氯吡格雷6.75 mg/kg；苯巴比妥組每日按75 mg/kg劑量腹腔注射苯巴比妥。

1.3.2大鼠肝微粒體的制備上述各組大鼠末次給藥后，第2日拉頸椎處死動(dòng)物，打開腹腔，取出肝臟，立即放入0.25 mol/L冰冷的蔗糖溶液(pH7.4)中清洗，冰上用剪刀將肝臟剪碎，洗至無血色；取2 g已剪碎的肝臟，加入1 ml蔗糖溶液，用組織勻漿機(jī)于冰浴中制成勻漿；4℃下，先將樣品 20 000 r/min離心20 min后，再取上清液，于100 000 r/min離心60 min，棄去上清液，用0.1 mmol/L Tris鹽酸(Tris-HCl)緩沖液(pH7.4)將沉淀懸浮均勻，-80℃保存。

1.3.3肝微粒體蛋白濃度測(cè)定〔6〕以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，用NaOH稀釋肝微粒體樣品，依照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算肝微粒體中蛋白濃度。

1.3.4肝微粒體CYP450含量測(cè)定〔7〕分別記錄450 nm和490 nm下各樣品的吸收度，根據(jù)下式計(jì)算CYP450的含量，CYP450(nmol/mg protein)=〔A(450 nm-490 nm)1000〕/(91C)。

1.3.5肝微粒體CYP3A4亞型活性測(cè)定依據(jù)文獻(xiàn)選取咪達(dá)唑侖作為CYP3A4的特異性底物〔8〕，每個(gè)樣品建立500 μl孵育體系。孵育體系中各成分及其終濃度、反應(yīng)終止過程見文獻(xiàn)〔9〕。經(jīng)樣品處理后，采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測(cè)定咪達(dá)唑侖的代謝產(chǎn)物1′-羥基咪達(dá)唑侖的濃度，并計(jì)算出該代謝產(chǎn)物的生成速度。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS10.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1各組大鼠肝微粒體中CYP450含量氯吡格雷給藥組CYP450 含量〔(0.74±0.22)nmol/mg prot〕略高于對(duì)照組〔(0.72±0.24)nmol/mg prot〕，但二者之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);與對(duì)照組比較，苯巴比妥鈉給藥組CYP450含量〔(1.64±0.33)nmol/mg prot〕明顯增加(P<0.01)。

2.2各組大鼠肝微粒體CYP3A4活性對(duì)照組大鼠肝微粒體CYP 3A4的活性為(0.059 ± 0.012)nmol·mg-1·min-1，氯吡格雷給藥組大鼠肝微粒體CYP 3A4的活性為(0.042±0.007)nmol·mg-1·min-1，氯吡格雷給藥組明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。

3討論

心血管藥物應(yīng)用的長期性增加了其與其他藥物聯(lián)合應(yīng)用的機(jī)會(huì)，發(fā)生藥物間相互作用的可能性也隨之增加。氯吡格雷是臨床常用的抗血小板聚集藥物，研究表明，氯吡格雷可明顯降低經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)(PCI) 和急性冠脈綜合征(ACS)后各種缺血事件的發(fā)生率〔10〕。氯吡格雷與其他藥物聯(lián)用在老年人中非常常見。藥物聯(lián)用時(shí)，在吸收、分布、代謝、排泄4個(gè)階段均可發(fā)生藥物間相互作用，其中發(fā)生率最高的是代謝性相互作用。CYP450酶系是重要的藥物代謝酶，造成代謝性藥物相互作用的主要原因是CYP450酶系。而CYP3A4是CYP450中最重要的亞族，可參與約50%的藥物代謝〔11〕。對(duì)CYP3A4 活性有明顯影響的藥物，如與CYP3A4底物聯(lián)用，很可能會(huì)引起極其嚴(yán)重的藥物相互作用。

本試驗(yàn)結(jié)果提示，氯吡格雷可能會(huì)改變合并用藥時(shí)經(jīng)CYP3A4代謝藥物的代謝速率，為避免發(fā)生不良反應(yīng)，應(yīng)注意減少后者的用量。大鼠和人之間在藥物對(duì)肝微粒體酶的作用方面存在一定的種屬差異〔12〕，因此，氯吡格雷在臨床上是否會(huì)出現(xiàn)抑制CYP3A4活性的作用，還需進(jìn)一步研究。

4參考文獻(xiàn)

1Ma TK，Lam YY，Tan VP，etal.Impact of genetic and acquired alteration in cytochrome P450 system on pharmacologic and clinical response to clopidogrel〔J〕.Pharmacol Ther，2010;125(2):249-59.

2Kwok CS，Loke YK.Meta-analysis: the effects of proton pump inhibitors on cardiovascular events and mortality in patients receiving clopidogrel〔J〕.Aliment Pharmacol Ther，2010;31(8):810-23.

3Kostapanos MS，Milionis HJ，Elisaf MS.Rosuvastatin-associated adverse effects and drug-drug interactions in the clinical setting of dyslipidemia〔J〕.Am J Cardiovasc Drugs，2010;10(1):11-28.

4Park JJ，Park KW，Kang J，etal.CYP3A4 genetic status may be associated with increased vulnerability to the inhibitory effect of calcium-channel blockers on clopidogrel〔J〕.Circ J，2013;77(5):1289-96.

5Delavenne X，Magnin M，Basset T，etal.Investigation of drug-drug interactions between clopidogrel and fluoxetine〔J〕.Fundam Clin Pharmacol,2013;27(6):683-9.

6Lowry OH，Rosebrough NJ，F(xiàn)arr AL，etal.Protein measurement with the Folin phenol reagent〔J〕.J Biol Chem，1951; 193(1):265-75.

7Omura T，Sato R.The carbon monoxide-binding pigment of liver microsomes.Ⅰ.Evidence for its hemoprotein nature〔J〕.J Biol Chem，1964;239(7):2370-8.

8Qin CZ，Ren X，Tan ZR，etal.A high-throughput inhibition screening of major human cytochrome P450 enzymes using an in vitro cocktail and liquid chromatography-tandem mass spectrometry〔J〕.Biomed Chromatogr，2014;28(2):197-203.

9劉明遠(yuǎn)，楊光遠(yuǎn)，王躍新，等.褪黑素對(duì)大鼠肝微粒體細(xì)胞色素P450酶亞型CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4活性的影響〔J〕.中國老年學(xué)雜志,2011;31(11)：2018-9.

10Yusuf S，Zhao F，Mehta SR，etal.Effects of clopidogrel in addition to aspirin in patients with acute coronary syndromes without ST-segment elevation〔J〕.N Engl J Med，2001;345(7):494-502.

11Smith DA，Jones BC.Speculations on the substrate structure-activity relationship ( SSAR) of cytochrome P450 enzymes〔J〕.Biochem Pharmacol，1992;44(11):2089-98.

12Graham MJ，Lake BG.Induction of drug metabolism: species differences and toxicological relevance〔J〕.Toxicology，2008;254(3):184-91.

〔2015-03-11修回〕

(編輯袁左鳴)