郝冬翠

（吉林省吉林市傳染病醫(yī)院，吉林 吉林 132002）

熒光聚合酶鏈反應定量檢測丙型肝炎患者血清中的HCV RNA及其意義

郝冬翠

（吉林省吉林市傳染病醫(yī)院，吉林 吉林 132002）

目的 探討定量檢測丙型肝炎患者血清中HCV RNA與急、慢性病毒性肝炎和肝纖維化等疾病之間的關系，分析其與血清丙氨酸轉氨酶（ALT）水平之間的關系。方法 在本組試驗中，主要采用熒光聚合酶鏈反應（PCR）方法，以我院收治的103例不同臨床類型的丙型肝炎患者為研究對象，對其血清中的HCV RNA進行定量檢驗。結果 無癥狀HCV感染者血清HCV RNA含量顯著低于急性丙型肝炎、慢性丙型肝炎、肝硬化患者，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結論 血液中HCV RNA的檢測已成為HCV感染診斷，是丙型肝炎患者病毒藥物治療療效監(jiān)測及血液篩查的重要手段。在肝損害和肝臟疾病進展過程中，高水平HCV RNA發(fā)揮著重要的作用。

熒光聚合酶鏈反應；定量檢測；丙型肝炎；血清；HCV RNA；意義

全球慢性丙型肝炎病毒感染者1.7～2.0億，其中我國的感染者已超過0.4億，人群感染率約為3.2%。由此可見慢性丙型病毒性肝炎已成為我國嚴重的社會和公共衛(wèi)生問題[1]。本組實驗對丙型肝炎患者血清中HCV RNA含量與疾病程度、血清丙氨酸轉氨酶（ALT）水平之間的關系進行研究，現(xiàn)進行如下報道。

1　資料與方法

1.1臨床資料：選取2013年1月至2014年6月，在我院接診103例丙型肝炎患者作為主要研究對象，通過對患者進行調查和了解，男性患者63例，女性患者40例，年齡在20～65歲，平均年齡為（43.41±1.65）歲。其中62例患者有輸血史，根據(jù)全國肝炎會議制定的臨床診斷標準，沒有癥狀的丙型肝炎病毒（HCV）感染患者11例，急性肝炎23例，慢性肝炎58例，肝硬化巧11例。以上的病例中甲型肝炎、戊型肝炎病毒、乙型肝炎標志均未陰性，進行常規(guī)收集血清標本，將其置于-20 ℃的位置，對其進行統(tǒng)一檢測。在進行血清采集之前，103例病例均未接受干擾素等抗病毒的治療。

1.2方法：熒光PCR檢測HCV-RNA的主要原理是通過熒光能量進行傳遞，并在此基礎上，對兩條互補配對的核昔酸的雙鏈結構進行檢驗。通過對設計的雙鏈信號引物的互補鏈進行研究，兩條互補的鏈分別標記著熒光受體和供體，此信號的引物處于兩條互補雙鏈的結構之中，在此基礎上，熒光能量起著傳遞的作用，并在熒光的受體和供體之間傳遞，從而會形成相應的熒光。PCR將會重復循環(huán)進行，隨著變化信號引物的雙鏈互補結構將被分開，其中一條鏈會參與產物的合成，并成為產物合成的一部分，同時熒光會隨著雙鏈互補結構的分開而消失[2]。在整體過程中，熒光的強度會發(fā)生相應的變化，隨著我熒光強度的逐漸變化，其變化情況與反應中特異性擴增產物的量成比例關系。同時可根據(jù)純化HCV-RNA建立標準曲線，通過計算機軟件可計算出樣品中HCV-RNA的含量[3]。

在本組實驗進行檢驗過程中，主要采用美國（ABI）公司的7300熒光定量PCR檢測系統(tǒng)。它是一種結合熒光探針的擴增檢測技術，通過熒光信號的變化檢測丙肝病毒RNA，在PCR反應體系中加入熒光基團，利用對熒光信號積累的實時檢測來監(jiān)測整個PCR進程，最后通過校正曲線對未知模板進行定量分析。主要的試劑有HCV RNA陽性標準、熒光代R擴增引物、AMV逆轉錄酶、Taq-DNA聚合酶，HCV RNA陽性標準屬于純化的病毒RNA，將其置于-70 ℃保存。試驗需要設立陽性、空白、陰性、峰值對照，計算每份標本兩孔的均值。

1.3統(tǒng)計學分析：本次研究中，選擇統(tǒng)計學軟件SPSS15.0進行統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析，其中計數(shù)資料以n/%形式表示，采用卡方（χ2）對計數(shù)資料進行檢驗，計量資料以（）形式表式，采用（t）對計量資料進行檢驗，如P＜0.05，則表示差異有統(tǒng)計學意義。

2　結 果

103例丙型肝炎患者血清HCV RNA含量范圍在103～109拷貝/mL，無癥狀HCV感染者血清HCV RNA含量范圍在105.1～101.8拷貝/mL，急性丙型肝炎患者血清HCV RNA含量范圍在107.4～102.4拷貝/mL，慢性肝炎患者血清HCV RNA含量范圍在107.6～102.5拷貝/mL，慢性丙型肝炎患者血清HCV RNA含量范圍在107.8～103.0拷貝/mL。無癥狀HCV感染者血清HCV RNA含量顯著低于急性丙型肝炎、慢性丙型肝炎、肝硬化患者。差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。急性肝炎的HCV RNA水平低于慢性丙型肝炎，差異不明顯無統(tǒng)計學意義。

3　討 論

丙型肝炎病毒（HCV）主要指存在脂質外膜的單正鏈RNA病毒，其可引起腸道外感染，脂質外膜的單正鏈RNA病毒已經成為非甲非乙型肝炎的主要致病因子[4]。在通常情況下，丙型肝炎病毒中基因含量在血清中較低，一般常規(guī)的臨床檢測技術很難檢驗出來，當前通過應用自聚合酶鏈反應（PCR）技術方法進行檢測，檢測HCV RNA是顯示HCV感染的一個可靠方法，也是HCV感染的最特異性檢測，此方法為丙型肝炎病毒感染的診斷提供了有效的依據(jù)。

本組試驗主要采用巢式擴增和雙鏈引物，特異性得到明顯的增高，在整個檢驗的過程中，需要再半封閉的環(huán)境下進行，同時不需要電泳分析，這樣將在一定程度上減少了認為誤差和交叉污染的機會。熒光PCR是具有較高的靈敏度、特異性的一項HCV RNA定量檢測技術，同時模板提取及逆轉錄的效率直接提高了結果的準確性[5]。本組試驗結果顯示慢性丙型肝炎、急性丙型肝炎、肝硬化患者血清中的HCV RNA含量均高于無癥狀的丙型肝炎病毒（HCV）感染患者，表明在肝損害和肝臟疾病中，高水平的病毒復制可能發(fā)揮著重要的作用[6]，其中無癥狀的丙型肝炎病毒（HCV）所導致的肝細胞損害，在丙型肝炎發(fā)病機制中可能是很重要的一個方面。

[1]亓文騫.脾動脈栓塞對丙型肝炎肝硬化患者脾功能亢進的療效及其在Peg-IFNα-2a抗病毒治療中的應用價值探討[D].長春：吉林大學，2010.

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[5]吳大先，劉菲，劉洪波，等.轉錄介導擴增技術檢測慢性丙型肝炎患者血清中HCVRNA及與RT-PCR的比較[J].中南大學學報（醫(yī)學版)，2014，25（7)：664-672.

[6]張復春，唐小平，蔡曉莉，等.丙型肝炎病毒基因型與血清HCVRNA含量關系及其與干擾素應答的研究.中華微生物學和免疫學雜志，2012，18（3)：131-135.

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1671-8194（2015）25-0118-02