■周孟清 張 璐賈 峰 宴和平 謝申伍 趙銀麗 黃 進

（1河南工業(yè)大學生物工程學院，河南鄭州 450001；2.廣州市正農(nóng)飼料有限公司，廣東廣州 511450；3.云南東恒集團生物飼料公司，云南富源 655500）

飼料添加劑指各種用于強化畜禽飼料效果和有利于配合飼料生產(chǎn)和貯存的一類非營養(yǎng)性微量成分，來源于植物的飼料添加劑種類繁多，通過分離提取可以獲得無毒的植物活性成分。對動物無毒無害且有明顯促生長等有益作用，但還沒有獲得國家飼料添加劑標準認可的植物提取物可以被稱為準飼料添加劑。綠色天然的飼料添加劑級色素在蛋雞生產(chǎn)中是重要的組成部分，它有利于蛋黃著色，蛋黃顏色是禽蛋感官品質(zhì)評定的一個重要指標。非綠色天然色素對人體有不同程度的毒性（溫廣宇等，2003)，甚至會導致生育力下降、畸胎等。

山竹原名為莽吉柿，其果樹是藤黃科常綠喬木，原產(chǎn)于東南亞地區(qū)，對環(huán)境的要求十分嚴格，與榴蓮齊名，號稱“果中皇后”。山竹果實含有豐富的山酮素、羥基檸檬酸、微量元素（陳嘉曦等，2007)等成分，羥基檸檬酸（HCA）對抑制脂肪合成、抑制食欲和降低體重有著良好的功效，山酮素則具有止痛抗菌作用（Palakawong等，2013)，抗病毒，抗突變作用，對心血管系統(tǒng)也有很好的保護作用。山竹果皮含有氧雜蒽酮、單寧酸等物質(zhì)，氧雜蒽酮具有氧化（Moongkarndi等,2014)和抗癌作用（馮建光等，2009)。山竹殼色素是一種醇溶性色素，有較強的抗氧化性、抗熱性，具有良好的穩(wěn)定性（胥秀英等，2006)，其與蔗糖、葡萄糖、苯甲酸鈉等常用食品添加劑有非常好的混用性，Na+、K+、Ca2+、Zn2+、Mg2+及檸檬酸、VC 等不影響其穩(wěn)定性,但Cu2+會加深其顏色，還原劑、紫外光、NaHCO3對色素有減色的作用，F(xiàn)e3+對其具有破壞作用（章斌等，2011)。山竹殼是良好的天然食用和飼料用色素提取原料，其天然紅色素不僅安全，還具有一定的營養(yǎng)價值和藥理作用。

山竹殼色素分離提取是開發(fā)成飼料添加劑的重要步驟，傳統(tǒng)的分離方法具有耗時、耗能、提取率低、化學成分易改變等缺點，而膜分離技術具有無污染、無相變、能耗低、操作簡單等優(yōu)點（洪宜斌等,2003)，已經(jīng)廣泛的應用到各個領域。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮山竹(鄭州水果批發(fā)市場),無水乙醇（分析純，天津市天力化學試劑有限公司），鹽酸（分析純，洛陽昊華化學試劑有限公司）等。電子天平（上海精密科學儀器有限公司），JZ 7114號微型植物粉碎機（上海市嘉定糧油檢測儀器廠），101型電熱鼓風干燥箱(上海市實驗儀器總廠),20-270目篩(上虞市五四儀器篩具),D8023CTL-K4型微波爐（佛山市順德區(qū)美的微波爐電器制造有限公司）,723N-可見分光光度計（上?？萍加邢薰荆⒊瑸V膜（天津森諾過濾技術有限公司）。

1.2 試驗設計

采用4因素3水平的正交試驗設計，如表1所示。

表1 試驗因素及水平

1.3 標準曲線的制作

山竹殼色素經(jīng)超濾提取后，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀50度蒸發(fā)得到濃縮物質(zhì)作為標準品。配制30%乙醇-0.108%HCl混合液作溶劑，分別稱取標準品0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g，用上述溶劑溶解標準品并分別轉(zhuǎn)移至5個25 ml容量瓶內(nèi)，搖勻，靜止。以上述溶劑作為參比溶液，在波長為520 nm處測吸光度，重復以上操作，做平行試驗，做出標準曲線：y=26.081x+0.005（R2=0.978 1）。

圖1 山竹殼色素的標準曲線

1.4 試驗步驟及操作

新鮮山竹殼→洗凈→放入干燥箱烘干→粉碎→過篩→微波輔助乙醇溶解→粗過濾→濾液進行超濾→可見分光光度計測吸光度→各組分吸光度比較。

烘干：山竹10 kg去肉得山竹殼，50℃烘干10 h,測得水分含量為3%。

粉碎：將山竹殼粗破碎后，放入粉碎機內(nèi)粉碎，然后用30、100、200目的分級篩篩分，分別收取篩下物，篩上部分繼續(xù)用粉碎機粉碎，重復以上操作，將所得的所有篩下物分別放入原料袋內(nèi)保存，并做好標記。

溶劑配制：分別配制30%乙醇-0.108%HCl混合液，40%乙醇-0.108%HCl混合液，50%乙醇-0.108%HCl混合液，密封放置。

溶解：根據(jù)1∶10（g/ml）的料液比溶解不同粒度的山竹殼粉末約50 g。

微波處理：用微波爐輔助處理溶有山竹殼原料乙醇溶液，以利于分離提取。

超濾：用超濾裝置進行分離，分別針對不同溶劑濃度、粒度、微波處理時間、微波功率進行超濾以確定最佳的提取條件。

測量：用30%乙醇-0.108%HCl混合液提取劑作為參比溶液，將待測液置于520 nm波長下進行吸光度A測定。同樣將其它試驗組吸光度測定出來，并與標準曲線對照，得出提取率。

1.5 數(shù)據(jù)處理

應用分析軟件SPSS17.0 for Windows對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。不同處理的樣品數(shù)據(jù)顯著性差異采用一般線形模型方差分析(ANOVA，LSD檢驗)進行檢驗，數(shù)據(jù)結果以平均值(S)±標準差(SD)表示。

2 結果與分析

2.1 山竹殼色素類物質(zhì)超濾法分離的正交試驗

試驗采用4因素3水平的正交試驗設計，在料液比為1∶10（g/ml）,所用溶劑為220 ml，山竹殼顆粒質(zhì)量為50 g，山竹殼顆粒粒度、提取劑乙醇濃度、微波作用時間、微波功率4因素3水平條件下提取效果如表2所示。

表2 山竹殼色素類物質(zhì)微波輔助結合超濾法分離的正交試驗結果

2.2 正交試驗的方差分析和回歸分析

由主體間效應的檢驗可得：山竹殼粒度（A）和溶劑濃度(B)是影響山竹殼色素提取率大小的關鍵性因子(P＜0.05)。且隨溶劑濃度增加，山竹殼色素提取率有上升趨勢。隨著山竹殼粒徑減小，山竹殼色素提取率有上升趨勢。

由粒度在每個水平間的多重比較可得，30目與100目對吸光值影響差異不顯著(P＞0.05)，粒度在30目與200目對吸光值影響差異顯著（P＜0.05），100目與200目對吸光值影響差異不顯著(P＞0.05)，100目為提取試驗時應該注重的因素水平。

由溶劑濃度在每個水平間的多重比較可得，溶劑濃度水平中1與2比較差異不顯著(P＞0.05)，水平1與3比較差異顯著(P＜0.05)，水平2與3比較對吸光值的影響差異顯著(P＜0.05)，則水平2和3為提取試驗時應注重的因素水平。

因此，對山竹殼色素提取分離時，粒度和溶劑濃度對試驗結果的影響為主要因素，為試驗應該嚴格控制的因素。

回歸分析得到模型：y=-2.619+0.36X1+0.482X2-0.16X3-0.184X4,(P＜0.05)

當微波功率為160 W，作用時間為20 s時，方程變?yōu)椋簓=-31.899+0.36X1+0.482X2，所做響應面圖見圖2。

根據(jù)正交試驗結果回歸方程可知：A取A2、B取B2、C取C1、D取D2時山竹殼色素提取率達最高，即在本試驗中山竹殼色素分離的最好條件為：A2B2C1D2，所以用A2B2C1D2組合進行驗證試驗，試驗流程同上，最終得到的吸光度為1.121，小于6號處理組。而6號處理組A2B3C1D2的吸光度為1.316，是10個處理組合中吸光度最大的。即山竹外殼紅色素提取率最高的。所以，最優(yōu)處理組合為A2B3C1D2，即山竹殼粉末顆粒大小為過100目篩、提取溶劑為50%乙醇-0.108%HCl混合溶液、微波溶解功率為160 W、微波溶解時間為20 s。

3 討論

3.1 原料粒度對提取效果的影響

適宜的原料粒度有利于其中活性物質(zhì)的提取(馬雪松等，2006)，適宜的粒度不但增加了溶劑與原料的接觸面積，也減少了不必要的電力等能源的消耗。Chupin等(2015)研究了微波輔助法提取海岸松樹皮中活性物，發(fā)現(xiàn)在5種不同原料粒度下，提取得到的產(chǎn)物有差異。Krogell等(2013)研究了云杉皮木材中半纖維素的提取，0.5～12.5 mm不同粒徑木材顆粒對提取結果有強化作用，顆粒越小半纖維素得率越高。本試驗中原料的粒度分別為30目，100目，200目，不同的粒度對分離結果的影響差異顯著，結合粉碎耗能考慮，為了節(jié)約電力能源，粒度可以選擇100目大小。

3.2 溶劑濃度對提取效果的影響

溶劑濃度對提取效果的影響是一個重要因素，有些作者研究發(fā)現(xiàn)使用0.108%HCl-95%乙醇作為提取劑，提取山竹殼紅色素效果較好（胥秀英等，2006），李宇偉等(2012)研究金銀花中綠原酸的提取分離，發(fā)現(xiàn)乙醇用量為75%，時提取率較高，馬雪松等(2006)研究分離黃芪中甲苷，溶劑濃度60%效果最佳，溶劑濃度對試驗結果有顯著影響。本試驗中使用超濾裝置，結合方差分析和實際情況，溶劑濃度選在50%，溶劑濃度對分離結果影響顯著（P＜0.05）。

試驗過程中，已經(jīng)過濾好的山竹外殼紅色素溶液碰到蒸餾水時會產(chǎn)生一種乳白色的液體，其成分和結構需要后續(xù)試驗進行深入研究。

山竹殼色素具有一定的藥理及營養(yǎng)價值，其不僅對心血管系統(tǒng)有保護作用，且具備抗腫瘤、抗菌及抗氧化性等特性，可以說是一種安全可靠的天然食用色素，可以投入開發(fā)成食品和飼料添加劑。

3.3 超濾對提取效果的影響

本試驗中超濾對提取效果的影響沒有對照組，沒有直接數(shù)據(jù)說明其作用。而從膜過濾的特征來看，納濾、反滲透、超濾膜過濾具設備規(guī)模小、能耗低、分離效率高的特點。膜分離技術具有一系列優(yōu)點：膜分離過程的能耗比較低、適合熱敏性物質(zhì)分離、分離裝置簡單、操作方便、工藝適應性強、便于回收、沒有二次污染。也有研究者采用分子印記法（Piacham等，2015)、超臨界CO2法（Mishima等，2013)分離山竹中活性物質(zhì)，

4 結論

本試驗采用4因素3水平正交設計，分別對山竹殼顆粒大小、溶劑濃度、微波溶解時間和微波溶解功率進行研究，發(fā)現(xiàn)在料液比為1∶10的弱酸條件下，用過100目篩的山竹殼粉末、溶劑濃度為50%乙醇-0.108%HCl溶液、微波功率為160 W、微波溶解時間為20 s時，采用超濾結合微波輔助方法提取山竹殼紅色素，提取率為22.1%。本試驗的創(chuàng)新點在于采用了微波輔助與超濾膜分離相結合的方法，分離得到濃縮的山竹紅色素溶液，為未來人們將山竹殼紅色素開發(fā)成食品和飼料添加劑提供了一定的借鑒意義。