陳福春 潘琦 傅品 陸富年 陳洪雷

肺腺癌組織中基質(zhì)窖蛋白-1和LDH-B、PKM2的表達(dá)及其意義

陳福春 潘琦 傅品 陸富年 陳洪雷

目的探討基質(zhì)窖蛋白1（Cav-1）、乳酸脫氫酶B（LDH-B）和丙酮酸激酶2（PKM2）在人肺腺癌（PAC）組織中的表達(dá)并分析3者的相關(guān)性及其臨床意義。方法采用量子點(diǎn)免疫熒光組織化學(xué)（QDs-IHC）技術(shù)檢測(cè)68例PAC組織和16例非癌性肺組織中基質(zhì)Cav-1、LDH-B和PKM2的表達(dá)情況。結(jié)果基質(zhì)Cav-1在PAC組織的陽(yáng)性率為58．8%，與非癌變肺組織的陽(yáng)性率100%相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。肺腺癌組織中LDH-B和PKM2的陽(yáng)性率分別為76．5%、70．6%，均高于非癌性肺組織（均P＜0．05）。PAC中、低分化組PKM2的陽(yáng)性率均高于高分化組（均P＜0．05）。結(jié)論基質(zhì)Cav-1缺失，LDH-B、PKM2的高表達(dá)可能促進(jìn)PAC的惡性進(jìn)展。

肺腺癌 窖蛋白1 乳酸脫氫酶B 丙酮酸激酶2 腫瘤能量代謝

我國(guó)肺癌發(fā)病率總體上呈不斷上升的趨勢(shì)，其中非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）的發(fā)病率約為80%，而肺腺癌（pulmonary adenocarcinoma，PAC）就占40%。PAC極易發(fā)生區(qū)域淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，發(fā)病率和病死率逐漸增高，所以尋找PAC的發(fā)病機(jī)制十分重要。微環(huán)境在腫瘤的形成、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用，其中最重要的是成纖維細(xì)胞。成纖維細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞相互作用后被活化，稱(chēng)為癌相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs），可以促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[1]。窖蛋白-1（caveolin-1，Cav-1）是caveolins家族中重要的一員，對(duì)腫瘤的發(fā)生有促進(jìn)和抑制雙重作用。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)成纖維細(xì)胞中Cav-1表達(dá)的缺失可促使其活化為CAFs，并作為胃癌、結(jié)腸癌一項(xiàng)獨(dú)立的不良預(yù)后指標(biāo)[2-3]。氧充足的條件下，腫瘤細(xì)胞糖酵解代謝同樣明顯活躍，稱(chēng)為瓦博格效應(yīng)[1]?；|(zhì)Cav-1的缺失是否可以促進(jìn)PAC的侵襲和轉(zhuǎn)移，以及它的機(jī)制是否通過(guò)上調(diào)需氧糖酵解的酶[丙酮酸激酶M2（pyruvate kinase M2，PKM2）和左旋乳酸脫氫酶B（L-lactate dehydrogenase B，LDH-B）]仍然未知。本研究利用量子點(diǎn)免疫熒光組織化學(xué)（quantum dots immunofluorescent histochemistry，QDs-IHC）技術(shù)檢測(cè)基質(zhì)Cav-1、LDH-B和PKM2在PAC組織中的表達(dá)并分析其臨床意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象和試劑 收集我院2007年1月至2011年1月手術(shù)切除后的PAC標(biāo)本68例，其中非癌變肺組織16例。所有組織術(shù)前均未經(jīng)放化療，經(jīng)10%中性緩沖甲醛固定24h。68例PAC患者中男43例，女25例，年齡33～74，平均56.4歲。采用2009年國(guó)際抗癌聯(lián)盟（UICC）第7版肺癌TNM分期，Ⅰ期46例，Ⅱ期+Ⅲ期22例；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PAC組織17例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PAC組織51例；組織學(xué)分級(jí)為Ⅰ級(jí)27例，Ⅱ級(jí)+Ⅲ級(jí)41例。兔抗人Cav-1和PKM2多克隆抗體（美國(guó)CST公司，濃度分別為1∶400、1∶50），鼠抗人LDH-B單克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz公司，濃度為1∶100）；生物素化羊抗兔、鼠IgG（美國(guó)Vector公司，濃度均為1∶400）。量子點(diǎn)超敏熒光試劑盒（605nm QD標(biāo)記的鏈霉親和素，605nm QDs-SA）購(gòu)自武漢珈源量子點(diǎn)技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。

1.2 方法 QDs-IHC檢測(cè)蛋白表達(dá)參照文獻(xiàn)[5]，組織切片滴加90%甘油封片后，上熒光顯微鏡Olympus BX51（CCD DP72）藍(lán)光激發(fā)，以細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)紅色的熒光顆粒為陽(yáng)性。用TBS代替一抗作空白對(duì)照，用已知陽(yáng)性片作陽(yáng)性對(duì)照。觀(guān)察顯示基質(zhì)Cav-1蛋白定位于胞膜和胞漿內(nèi)，PKM2蛋白定位于胞漿內(nèi)，而LDH-B定位于胞核內(nèi)?；|(zhì)Cav-1采用半定量評(píng)分方法：高倍鏡下每塊組織或每芯選3個(gè)視野，按基質(zhì)CAFs陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比計(jì)分，陰性為0分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤30%為1分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＞30%為2分，0分表示基質(zhì)Cav-1表達(dá)缺失，1、2分表示基質(zhì)Cav-1表達(dá)陽(yáng)性[6]。腫瘤細(xì)胞LDH-B和PKM2采用半定量評(píng)分方法[7]，高倍鏡下每塊組織或每芯選3個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞。先按染色強(qiáng)度計(jì)分：無(wú)色為0分，淡紅色為1分，紅色為2分，亮紅色為3分；再按陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比計(jì)分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)1%～10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＞75%為4分，兩種積分相乘≥2判為免疫熒光組織化學(xué)陽(yáng)性表達(dá)。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)和四格表精確概率法，基質(zhì)Cav-1與LDH-B、PKM2之間的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 基質(zhì)Cav-1的表達(dá)情況 基質(zhì)Cav-1主要表達(dá)于正常肺泡上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和脂肪細(xì)胞等，在腫瘤的CAFs和腫瘤細(xì)胞中也有部分表達(dá)，見(jiàn)圖1、2。68例PAC組織中基質(zhì)Cav-1表達(dá)的陽(yáng)性率為58.8%，與非癌變肺組織相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Cav-1表達(dá)陽(yáng)性率與PAC臨床病理參數(shù)均無(wú)關(guān)（均P＞0.05），詳見(jiàn)表1。

圖1 Cav-1在肺腺癌腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)，基質(zhì)陰性

表1 Cav-1在PAC中的表達(dá)及與臨床病理參數(shù)的關(guān)系[例（%）]

2.2 LDH-B、PKM2蛋白的表達(dá)情況 LDH-B蛋白主要表達(dá)在癌細(xì)胞的胞核和胞質(zhì)，基質(zhì)也有少量表達(dá)，而在癌旁正常組織中幾乎不表達(dá)，見(jiàn)圖3。PKM2蛋白主要表達(dá)于癌細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，在癌旁正常組織中幾乎不表達(dá)，在腫瘤周?chē)腃AFs中也有部分表達(dá)，見(jiàn)圖4。68例PAC組織中LDH-B蛋白表達(dá)的陽(yáng)性率為76.5%，PKM2表達(dá)的陽(yáng)性率為70.6%，與非癌變肺組織（18.8%、12.5%）相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。LDHB的表達(dá)與PAC的臨床病理參數(shù)均無(wú)關(guān)（均P＞0.05）；PKM2在PAC中、低分化組和高分化組的陽(yáng)性率分別為80.5%和55.6%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與其余的臨床病理參數(shù)均無(wú)關(guān)（均P＞0.05），詳見(jiàn)表2。

2.3 基質(zhì)Cav-1、LDH-B和PKM2蛋白表達(dá)之間的相關(guān)性 Cav-1陽(yáng)性而腫瘤細(xì)胞LDH-B陰性8例，Cav-1陰性而腫瘤細(xì)胞LDH-B陽(yáng)性20例，兩者無(wú)顯著相關(guān)性（r=0.099，P＞0.05）。基質(zhì)Cav-1陽(yáng)性而腫瘤細(xì)胞PKM2陰性11例，基質(zhì)Cav-1陰性而腫瘤細(xì)胞PKM2陽(yáng)性19例，兩者無(wú)顯著相關(guān)性（r=0.050，P＞0.05）。腫瘤細(xì)胞中PKM2和LDH-B共同陽(yáng)性10例，共同陰性14例，兩者無(wú)顯著相關(guān)性（r=0.098，P＞0.05）。

圖3 LDH-B在肺腺癌腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)，基質(zhì)陰性

圖4 PKM-2在肺腺癌腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)

表2 LDH-B和PKM-2在PAC中的表達(dá)及與臨床病理參數(shù)的關(guān)系[例（%）]

3 討論

PAC的進(jìn)展以及侵襲轉(zhuǎn)移和許多因素有關(guān)，涉及腫瘤細(xì)胞和周?chē)鷱?fù)雜微環(huán)境的相互作用。因此，深入研究PAC侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，尋找新的特異的分子標(biāo)志物對(duì)PAC進(jìn)行早期診斷與治療十分重要。

3.1 基質(zhì)Cav-1在PAC中的表達(dá)和臨床意義 Caveolin家族有3個(gè)成員，Cav-1、Cav-2和Cav-3。Caveolins均參與細(xì)胞吞噬，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及膽固醇運(yùn)輸?shù)?。其中Cav-1是最重要的結(jié)構(gòu)和功能組分，通過(guò)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞膜運(yùn)輸、基因調(diào)節(jié)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等在腫瘤形成中發(fā)揮著重要作用[8]。近年研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤微環(huán)境中成纖維細(xì)胞可以促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，成纖維細(xì)胞中Cav-1的缺失是其中一項(xiàng)可能的機(jī)制[2]。本研究顯示，基質(zhì)Cav-1蛋白在PAC組織中的陽(yáng)性表達(dá)率顯著低于對(duì)照組，表明在PAC的惡性進(jìn)展中，基質(zhì)Cav-1的缺失發(fā)揮了重要作用，這與El-Gendi等[9]和Di Vizio等[10]在乳腺癌和前列腺癌中的研究結(jié)果部分一致?；|(zhì)Cav-1表達(dá)的陽(yáng)性率與PAC的臨床病理參數(shù)均無(wú)關(guān)，可能與研究的病例數(shù)較少有關(guān)。Goetz等[11]通過(guò)三維培養(yǎng)證實(shí)基質(zhì)Cav-1表達(dá)有助于腫瘤細(xì)胞的延伸，在腫瘤轉(zhuǎn)移部位表達(dá)明顯增加，并且與腫瘤的不良預(yù)后有關(guān)。Sun等[12]在73例宮頸癌的研究中發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)Cav-1的缺失和宮頸癌的臨床病理學(xué)參數(shù)無(wú)關(guān)，結(jié)合我們的結(jié)果，提示基質(zhì)Cav-1的缺失還不能作為所有上皮性腫瘤的預(yù)后指標(biāo)，可能也與腫瘤的組織學(xué)類(lèi)型有關(guān)，需要進(jìn)一步通過(guò)多種途徑進(jìn)行研究。

3.2 LDH-B在PAC中的表達(dá)和臨床意義 丙酮酸鹽既是糖酵解的產(chǎn)物，又是三羧酸循環(huán)的原料，是許多不同代謝途徑的樞紐。真核生物中，乳酸脫氫酶（LDHs）是由兩型亞基（M型和H型）構(gòu)成的四聚體，催化丙酮酸鹽和乳酸鹽之間的可逆反應(yīng)。LDH-B基因編碼H型亞基；LDH-A是HIF-1的靶基因，編碼M型亞基。這兩型亞基以不同的比例組成 5種同工酶：LDH1～LDH5。LDHs和腫瘤關(guān)系密切，伴有血清LDHs增高的患者預(yù)后較差。本研究顯示，LDH-B蛋白在PAC組織中的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于對(duì)照組，表明LDH-B蛋白表達(dá)上調(diào)可能促進(jìn)PAC的惡性進(jìn)展。本研究發(fā)現(xiàn)，LDH-B蛋白的陽(yáng)性率和PAC患者的臨床病理參數(shù)均無(wú)顯著相關(guān)性。LDH-B（存在于LDH-1）的功能主要是將乳酸鹽轉(zhuǎn)變?yōu)楸猁}。Ubaldo等[13]發(fā)現(xiàn)糖酵解的終產(chǎn)物丙酮酸鹽可以促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果和以往的報(bào)道[14]，可推測(cè)腫瘤細(xì)胞（非CAFs）中LDH-B表達(dá)增強(qiáng)可能與PAC的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)，需要擴(kuò)大病例繼續(xù)研究。

3.3 PKM2在PAC中的表達(dá)和生物學(xué)意義 丙酮酸激酶是糖酵解過(guò)程的一個(gè)限速酶，催化磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）去磷酸化為丙酮酸鹽從而產(chǎn)生ATP。丙酮酸激酶有4個(gè)亞型：PKM1、PKM2、PKL和PKR，分別表達(dá)于不同的細(xì)胞類(lèi)型[15]。腫瘤形成過(guò)程中，PKM1、PKL和PKR被PKM2所取代。許多腫瘤細(xì)胞中PKM2的表達(dá)上調(diào)，如乳腺癌、肺癌、胃癌、宮頸癌、口腔鱗癌和結(jié)腸癌等[15-18]。PKM2可以協(xié)同HIF-1促進(jìn)需氧糖酵解和腫瘤血管生成[19]。本研究顯示，PKM2蛋白在PAC組織中的陽(yáng)性率顯著高于對(duì)照組，表明PKM2蛋白表達(dá)上調(diào)可能促進(jìn)PAC的惡性進(jìn)展。PKM2蛋白在PAC中、低分化組和高分化組的陽(yáng)性率分別為80.5%和55.6%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明PKM2蛋白高表達(dá)預(yù)示PAC分化不良，與在口腔鱗癌中的報(bào)道類(lèi)似，并可作為不良預(yù)后的指標(biāo)[17]。據(jù)此推測(cè)，丙酮酸鹽可以促進(jìn)PAC的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，依據(jù)可能是腫瘤細(xì)胞中PKM2的高表達(dá)。

3.4 基質(zhì)Cav-1、LDH-B、PKM2在PAC中的關(guān)系 Bonuccelli等[13]建立的人異種移植動(dòng)物模型及免疫組化中也發(fā)現(xiàn)，Cav-1缺失的CAFs中LDH-B和PKM2的表達(dá)上調(diào)，這個(gè)模型也符合經(jīng)典的瓦博格假說(shuō)。本研究顯示，基質(zhì)Cav-1、LDH-B、PKM2彼此之間均無(wú)顯著相關(guān)性，需要擴(kuò)大病例繼續(xù)研究。在以往的報(bào)道中，隨著基質(zhì)Cav-1表達(dá)降低，基質(zhì)中LDH-B和PKM2表達(dá)增強(qiáng)，表明PAC中存在逆轉(zhuǎn)的瓦博格效應(yīng)[14]。

腫瘤是一種代謝性疾病，需用有限的資源產(chǎn)生足夠的能量滿(mǎn)足腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，這就需要進(jìn)行需氧糖酵解。而CAFs中的需氧糖酵解相當(dāng)于一個(gè)工廠(chǎng)，不斷為腫瘤細(xì)胞的增殖提供能量?？傊|(zhì)Cav-1缺失、腫瘤細(xì)胞LDH-B和PKM2高表達(dá)，可能促進(jìn)肺腺癌的惡性進(jìn)展。

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Expression of stromal caveolin-1,LDH-B and PKM2 in pulmonary adenocarcinoma

ObjectiveTo investigate the expression of stromal caveolin-1(Cav-1),L-lactate dehydrogenase B (LDH-B)and pyruvate kinase M2(PKM2)in pulmonary adenocarcinoma(PAC)tissues．MethodsThe expression of stromal Cav-1,LDH-B and PKM2 proteins in 68 specimens of PAC and 16 specimens of noncancerous lung tissue with quantum dots immunofluorescent histochemistry(QDs-IHC),ResultsThe positive rates of stromal Cav-1 in PAC tissues and non-cancerous lung tissues were 58．8%and 100．0%(P＜0．05)．The positive rates of LDH-B and PKM2 expression in PAC tissues were 76．5% and 70．6%,respectively,which were higher than those in noncancerous lung tissues(P＜0．05)．The expression of PKM2 in middle/low-differentiated PAC was higher than that in well-differentiated PAC(P＜0．05)．ConclusionThe results indicated that stromal Cav-1 is down-regulated and LDH-B and PKM2 are up-regulated in pulmonary adenocarcinoma．

Pulmonary adenocarcinoma Caveolin-1 L-lactate dehydrogenase B Pyruvate kinase M2 Tumor energy metabolism

2015-04-10）

（本文編輯：田云鵬）

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（編號(hào)：30500226）

317500 溫嶺市中醫(yī)院胸外科（陳福春、潘琦、陳洪雷）；武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室（傅品、陸富年）