袁海建， 安益強(qiáng)， 王 卉*， 陳宜剛

（1.泰州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇泰州225300；2.徐州醫(yī)學(xué)院，江蘇徐州221000）

銀杏內(nèi)酯B凍干粉針處方和凍干工藝的研究

袁海建1， 安益強(qiáng)2， 王 卉1*， 陳宜剛1

（1.泰州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇泰州225300；2.徐州醫(yī)學(xué)院，江蘇徐州221000）

目的對(duì)銀杏內(nèi)酯B凍干粉針劑處方和凍干工藝進(jìn)行研究。方法選取助溶劑聚乙二醇400用量 （A）、增溶劑聚乙二醇-12-羥基硬脂酸酯用量 （B）和賦型劑甘露醇用量 （C）為主要考察因素，以藥液中銀杏內(nèi)酯B、制劑溶解性為評(píng)價(jià)指標(biāo)，建立L9（34）正交實(shí)驗(yàn)以確定最優(yōu)處方；以藥液共熔點(diǎn)、成品凍干情況和殘余水分為質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定最優(yōu)的凍干工藝。結(jié)果最優(yōu)處方為A3B2C3；最優(yōu)凍干工藝為預(yù)凍溫度-45℃，保持4 h，升華干燥以0.1℃/min的速率升溫至-15℃，保持12 h，解吸附干燥升溫至30℃，保持6 h。以最優(yōu)處方和凍干工藝制備的3批銀杏內(nèi)酯B凍干粉針樣品的外觀良好均一，復(fù)溶性好，含量和有關(guān)物質(zhì)等指標(biāo)均符合要求。結(jié)論該處方及凍干工藝的可行性和重現(xiàn)性較理想，可為新藥的研制和申報(bào)奠定基礎(chǔ)。

銀杏內(nèi)酯B；凍干粉針劑；處方篩選；凍干工藝研究

銀杏內(nèi)酯（ginkgolides，GG）是銀杏葉提取物中主要的活性成分，對(duì)血小板活化因子 （PAF）受體有較強(qiáng)的拮抗作用，并具有多種顯著的藥理活性，在心腦血管系統(tǒng)疾病的治療上效果理想，有良好的臨床應(yīng)用前景［1］。目前，國(guó)內(nèi)已有相應(yīng)銀杏內(nèi)酯注射液上市，受到廣泛的應(yīng)用［2-3］，但凍干粉針尚未上市。從藥物穩(wěn)定性、儲(chǔ)存和運(yùn)輸方面考慮，凍干粉針要優(yōu)于注射液，且銀杏內(nèi)酯中的銀杏內(nèi)酯B（ginkgolide B，GB）為主要藥效成分，拮抗PAF受體的作用最強(qiáng)［4］，故本實(shí)驗(yàn)選用銀杏內(nèi)酯B進(jìn)行凍干粉針處方篩選和工藝的研究，為其研制和申報(bào)奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

Triad 2.5L冷凍干燥機(jī)（美國(guó)Labcono公司）；電子天平（美國(guó)梅特勒-托利多公司）；RCT basic電磁攪拌器（德國(guó)IKA公司）；Q2000差示量熱掃描儀 （美國(guó)TA公司）；ZS90納米粒度儀 （英國(guó)馬爾文儀器有限公司）；Agilent 1200型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent Techologies公司）；C20卡爾費(fèi)休水分測(cè)定儀 （美國(guó)梅特勒-托利多公司）。

銀杏內(nèi)酯B（南京海陵中藥制藥工藝技術(shù)研究有限公司，純度≥98%）；注射級(jí)聚乙二醇400（南京威爾化工有限公司）；注射級(jí)甘露醇 （法國(guó)羅蓋特公司）；聚乙二醇-12-羥基硬脂酸酯 （德國(guó)BASF公司）；注射用水 （焦作市康華藥業(yè)有限公司）；乳糖、葡萄糖、海藻糖為分析純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 處方研究

2.1.1 規(guī)格確定 根據(jù)目前正在進(jìn)行臨床三期研究的由中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院開(kāi)發(fā)的一類新藥銀杏內(nèi)酯B注射液，確定其規(guī)格為40 mg/支。

2.1.2 制備方法確定 取處方量的銀杏內(nèi)酯B原料藥溶解于一定量助溶劑和增溶劑中，另取適量賦型劑溶于注射用水中，攪拌狀態(tài)下滴加到前一溶液，混勻后即得藥液。后經(jīng)除熱源過(guò)濾、除菌過(guò)濾、灌裝、凍干、壓塞和軋蓋，即得銀杏內(nèi)酯B凍干粉針制劑。

2.1.3 助溶劑選擇 由于銀杏內(nèi)酯B在水中的溶解度極低，小于0.1 mg/mL［5］，而制備凍干制劑所配的溶劑通常為水，且溶劑量不能過(guò)大，所以需要用助溶劑來(lái)增加銀杏內(nèi)酯B的溶解度。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，銀杏內(nèi)酯B在聚乙二醇400、丙二醇和乙醇中均有較高的溶解度，但考慮到凍干制劑的特殊性，需復(fù)溶成溶液才能進(jìn)行注射給藥。由于丙二醇和乙醇的沸點(diǎn)較低，在干燥階段容易升華，導(dǎo)致難以復(fù)溶，故采用聚乙二醇400作為助溶劑，參考FDA IIG和The Handbook of Pharmaceutical Excipients數(shù)據(jù)，其用量的體積分?jǐn)?shù)不超過(guò)11.25%。

2.1.4 增溶劑選擇 取處方量的銀杏內(nèi)酯B溶于一定量聚乙二醇400中，攪拌狀態(tài)下滴加處方量的注射用水，由于此時(shí)藥物會(huì)大量析出，故需一定增溶劑來(lái)增加藥物在水中的溶解度。目前用于注射制劑中常用的增溶劑有吐溫80、聚氧乙烯氫化蓖麻油、聚乙二醇-12-羥基硬脂酸酯［6］。研究表明［7］，相對(duì)于吐溫80和聚氧乙烯氫化蓖麻油，聚乙二醇-12-羥基硬脂酸酯因其組胺釋放少、溶血作用低、增溶能力高而受到越來(lái)越多的關(guān)注和重視，因此實(shí)驗(yàn)選用聚乙二醇-12-羥基硬脂酸酯作為本制劑的增溶劑，參考國(guó)外毒理研究和注射劑臨床研究的規(guī)定［7-8］，設(shè)定其用量的體積分?jǐn)?shù)不超過(guò)10%。

取處方量的銀杏內(nèi)酯B原料藥溶解于體積分?jǐn)?shù)為10%的聚乙二醇400和體積分?jǐn)?shù)為10%的聚乙二醇-12-羥基硬脂酸酯中，攪拌狀態(tài)下滴加處方量的注射用水，制備得到澄清透明藥液。然后將其冷藏，避光放置12 h，有關(guān)物質(zhì)和溶液的澄清度無(wú)明顯變化，也無(wú)固體析出，說(shuō)明其穩(wěn)定性良好。

2.1.5 賦型劑篩選 常用的凍干賦型劑有甘露醇、乳糖、葡萄糖、海藻糖，用量大致相當(dāng)［9］。本實(shí)驗(yàn)選用體積分?jǐn)?shù)為5%的各種賦型劑，在其他因素均相同的情況下，分別制備和凍制，結(jié)果見(jiàn)表1。由表可知，甘露醇為較理想的賦型劑。

表1 賦型劑篩選結(jié)果

2.1.6 處方正交篩選 根據(jù)前期研究結(jié)果，以助溶劑用量（A）、增溶劑用量 （B）和賦型劑用量 （C）為主要考察因素，以凍干前藥液中銀杏內(nèi)酯B的含有量 （過(guò)0.22μm濾膜后進(jìn)行檢測(cè)）、制劑溶解性為評(píng)價(jià)指標(biāo)，建立L9（34）正交試驗(yàn)，因素水平見(jiàn)表2，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。由表可知，以藥液中銀杏內(nèi)酯B的含有量的直觀極差分析，影響大小為A＞B＞C，最佳處方為A3B3C3；以制劑溶解性的直觀極差分析，影響順序?yàn)锽＞C＞A，最佳處方為B2C2A2。

銀杏內(nèi)酯B采用HPLC法測(cè)定，外標(biāo)法計(jì)算其含有量。色譜條件為Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×150 mm，5μm）色譜柱；流動(dòng)相為乙腈-0.02%氨水 （30∶70）；體積流量1.0 m L/m in；柱溫30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)225 nm；進(jìn)樣體積10μL。供試品溶液配制方法為取藥液適量，過(guò)0.22 μm濾膜，續(xù)濾液用乙腈稀釋10倍，混勻后離心，取上清液即得。對(duì)照品溶液配制方法為精密稱取銀杏內(nèi)酯B對(duì)照品10 mg，置于10 mL量瓶中，乙腈溶解并稀釋定容至刻度，混勻后即得。

另外，方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。銀杏內(nèi)酯B的含有量表明，只有A因素有顯著性差異 （P＜0.05），以A3為最佳；溶解性表明，只有B因素有顯著性差異 （P＜0.05），以B2為最佳；C因素 （即甘露醇的用量）在兩個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)中均無(wú)顯著性差異 （P＞0.05），但發(fā)現(xiàn)當(dāng)其用量為8%時(shí)，凍干餅狀物的外觀更飽滿，而且品質(zhì)更優(yōu)良，故甘露醇用量選擇為8%。綜上所述，確定最佳的工藝處方為A3B2C3，即聚乙二醇400用量為10%，聚乙二醇-12-羥基硬脂酸酯用量為6%，甘露醇用量為8%。

表2 因素水平

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4 方差分析結(jié)果

2.2 凍干工藝的研究

2.2.1 共熔點(diǎn)的測(cè)定 采用DSC法進(jìn)行測(cè)定。取少量最優(yōu)處方配制的藥液于樣品皿中，以空樣品皿為參比，-50℃下保持10 min后開(kāi)始升溫，升溫速率為1℃/min，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖可知，經(jīng) -50℃預(yù)凍的處方溶液在-14℃時(shí)開(kāi)始發(fā)生熔融吸熱，說(shuō)明最低共熔點(diǎn)為-14℃，而樣品溶液預(yù)凍溫度應(yīng)至少低于20℃ （最低共熔點(diǎn)）時(shí)［10］，才能充分預(yù)凍，故本制劑預(yù)凍溫度設(shè)定在-45℃。

2.2.2 工藝的研究 研究發(fā)現(xiàn)，在預(yù)凍溫度-45℃，保持3 h時(shí)，樣品溶液就能完全凍實(shí)。升華干燥階段升溫速率不能過(guò)高，否則會(huì)導(dǎo)致噴瓶，最終確定升溫速率為0.1℃/min，升至-15℃，保持至少12 h，此條件下水分基本升華完全，且無(wú)噴瓶現(xiàn)象發(fā)生。在解吸附干燥階段，采用25℃，保持至少6 h，此條件下樣品水分能控制在3%以下。

圖1 共熔點(diǎn)測(cè)定結(jié)果

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 按照最優(yōu)處方，即聚乙二醇400用量10%、聚乙二醇-12-羥基硬脂酸酯用量 6%、甘露醇 50 mg/mL，根據(jù) “2.1.2”項(xiàng)工藝配制銀杏內(nèi)酯B藥液，每個(gè)西林瓶灌裝4 mL藥液，批量為1 000支，采用最優(yōu)凍干工藝進(jìn)行凍制。（1）預(yù)凍：溫度-45℃，保持4 h。（2）升華干燥：以0.1℃/min升溫至-15℃，保持12 h。（3）解吸附干燥：升溫至30℃，保持6 h。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3批樣品外觀均為類白色疏松塊狀物，凍干前銀杏內(nèi)酯B含有量分別為100.2%、99.8%和100.1%，制劑溶解性分別為18 s、20 s和17 s，說(shuō)明該處方符合要求，且重復(fù)性良好。另外，成品制劑的銀杏內(nèi)酯B含有量均在95.0%～105.0%之間，而且有關(guān)物質(zhì)、無(wú)菌、內(nèi)毒素均符合規(guī)定，其他各項(xiàng)指標(biāo)也均符合凍干制劑的相關(guān)規(guī)定。

3 討論

本研究對(duì)銀杏內(nèi)酯B凍干粉針的處方和工藝進(jìn)行研制，取得了較理想的結(jié)果，解決了銀杏內(nèi)酯B注射液的一些不足，應(yīng)用前景較為廣泛。在本實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用聚乙二醇400和聚乙二醇-12-羥基硬脂酸酯來(lái)解決銀杏內(nèi)酯B在水中溶解度非常差的問(wèn)題，用量均在安全用量范圍，而且在國(guó)內(nèi)均有市售的相應(yīng)注射級(jí)輔料，安全性有所保障，能滿足國(guó)內(nèi)臨床新藥的申報(bào)要求。

用水對(duì)該制劑復(fù)溶后，藥液用納米粒度儀進(jìn)行粒徑檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖可知，復(fù)溶后藥液中微粒的粒徑均在10 nm以下。由此推測(cè)，在制備過(guò)程中可能形成一個(gè)穩(wěn)定的納米膠束體系，銀杏內(nèi)酯B被聚乙二醇400和聚乙二醇-12-羥基硬脂酸酯體系的膠束包埋，從而增加了水溶性。

圖2 復(fù)溶后藥液粒徑測(cè)定結(jié)果

采用該處方工藝制備的銀杏內(nèi)酯B凍干粉針在外觀和性狀方面具有較好的均一性；加入注射用水后，復(fù)溶情況良好；成品水分均低于3%，穩(wěn)定性較好，易于長(zhǎng)期保存和運(yùn)輸；進(jìn)行加速試驗(yàn)后，成品各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)均無(wú)明顯變化。由此可知，該制劑處方工藝成熟穩(wěn)定、質(zhì)量可控性良好，為銀杏內(nèi)酯B凍干粉劑新藥的研制和申報(bào)奠定了基礎(chǔ)。

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R944

：B

：1001-1528（2015）07-1600-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.07.048

2014-07-18

泰州職業(yè)技術(shù)學(xué)院 “博碩基金”項(xiàng)目 （TZYBS-12-7）；2013年江蘇省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目 （201312106012Y）；泰州市科技局項(xiàng)目 （1828666KY4）

袁海建 （1981—），男，碩士，講師，研究方向?yàn)橹兴幮聞┬团c新技術(shù)。E-mail：yuanjian8101@163.com

*通信作者：王 卉 （1974—），女，碩士，副教授，研究方向?yàn)樾滤幩幚韺W(xué)。