聶 晶， 苗 水， 李雯婷， 毛秀紅， 季 申*

（1.上海醫(yī)藥工業(yè)研究院，上海200040；2.上海食品藥品檢驗所，上海201203）

[質量]

黃芪浸膏質量標準的研究

聶 晶1，2， 苗 水2， 李雯婷2， 毛秀紅2， 季 申2*

（1.上海醫(yī)藥工業(yè)研究院，上海200040；2.上海食品藥品檢驗所，上海201203）

目的建立黃芪浸膏的質量標準。方法采用薄層色譜 （TLC）法對黃芪浸膏中的黃芪甲苷進行定性鑒別，應用HPLC法對黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷進行定量測定。結果薄層色譜斑點清晰，分離度良好；黃芪甲苷及毛蕊異黃酮葡萄糖苷在測定范圍內均表現(xiàn)出良好的線性 （r＞0.999），方法的平均回收率在97.5%～100.5%之間。結論定量的方法在Pheomenex Luna C18（0.46 cm×25 cm，5μm），Agilent Eclipse XDB-C18（0.46 cm×25 cm，5μm），Waters XBridgeShieldrp18（0.46 cm×15 cm，5μm）和Welch Xtimate C18（0.46 cm×15 cm，5μm）4根色譜柱具有良好的精密度和重現(xiàn)性，結果準確可靠。

黃芪浸膏；黃芪甲苷；毛蕊異黃酮葡萄糖苷；薄層色譜；高效液相色譜

藥用黃芪為多年生草本植物豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus（Fisch.）Bge.Var，mongholicus（Bge.）Hsiao或膜莢黃芪Astragalusmembranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根，性溫味甘，具有補氣固表、斂汗固脫、托瘡生肌、利水消腫之功效［1-5］。腦絡通膠囊收載于衛(wèi)生部藥品標準中藥成方制劑19冊 （標準號：WS3-B-3667-98）［6］，由黃芪浸膏、丹參浸膏、川芎浸膏等藥味組成，主要用于補氣活血，通經(jīng)活絡［7-8］；其中黃芪浸膏是處方中的主要藥味，是由黃芪經(jīng)水提而制成的黃棕色至黑褐色的粉末或塊狀物。衛(wèi)生部標準對腦絡通膠囊中黃芪浸膏僅規(guī)定了制法［6］，缺少具體質量標準控制方法，不能有效保證投料用黃芪浸膏的質量。黃芪化學成分眾多，其中黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷對細胞免疫功能具有促進作用，是目前質量標準控制較多的指標性成分［9］?，F(xiàn)有文獻中關于這兩種成分定量測定研究較多，其測定方法主要有高效液相色譜法、薄層色譜掃描法，鑒別方法一般采用傳統(tǒng)的薄層分析方法［10-15］。《中國藥典》2010年版對黃芪質量進行了全面的控制，采用對照藥材和黃芪甲苷對照品制訂了薄層鑒別方法，采用HPLC法對黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷進行了含量測定，此外還規(guī)定了水分、灰分等檢查項［16］。為了更好地保障腦絡通膠囊的質量，本實驗參照黃芪的質量控制方法，對腦絡通膠囊中的黃芪浸膏進行了系統(tǒng)的研究，制訂了黃芪浸膏的質量標準。相較于 《中國藥典》2010年版黃芪質量標準，本方法新增訂了特征指紋圖譜質量控制方法［17-19］，更好地控制了黃芪浸膏中黃酮醇苷類化合物。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1100高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；蒸發(fā)光散射檢測器（Varian 385-LC）；Agilent1260型高效液相色譜儀（美國Agilent公司），DAD檢測器；Sartorius BS 2202S電子天平。

1.2 藥品及試劑 黃芪甲苷對照品 （批號0781-200210，供含量測定用）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品 （批號877-200001，供含量測定用）、黃芪對照藥材 （批號120974-201311，供薄層鑒別用）均購自中國藥品生物制品檢定所。芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素供特征圖譜定位用；乙腈為色譜純（MERCK公司）；其余均為分析純，由中國醫(yī)藥（集團）上?；瘜W試劑公司提供。

2 方法與結果

2.1 定性鑒別 （黃芪浸膏的TLC鑒別） 參照《中國藥典》2010年版 “黃芪” 項下的規(guī)定［16］，取黃芪對照藥材2 g，置圓底燒瓶中，加入80%甲醇50 mL，加熱回流2 h，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加水20mL使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取2次，每次20 mL，合并正丁醇液，用氨試液30 mL洗滌，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為對照藥材溶液。另取黃芪甲苷對照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法 （《中國藥典》2010年版一部附錄ⅥB）試驗，吸取 “2.2.3”項下的供試品溶液及上述對照藥材、對照品溶液各5～10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-甲醇-水 （13∶7∶2）的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105°C加熱至斑點顯色清晰，分別置日光和紫外光燈（365 nm）下檢視。結果顯示供試品色譜中，在與黃芪對照藥材色譜相應的位置上，日光下顯相同顏色的主斑點，紫外光燈 （365 nm）下顯相同顏色的熒光斑點；與黃芪甲苷對照品色譜相應的位置上，日光下顯相同顏色的斑點，紫外光燈 （365 nm）下顯相同顏色的熒光斑點。結果表明TLC分離效果良好 （見圖1）。

圖1 黃芪提取物的薄層色譜圖(T:20℃RH:50%)Fig.1 TLC of Astragalus extract(T:20℃RH:50%)

2.2 黃芪甲苷測定

2.2.1 色譜條件 Pheomenex Luna C18色譜柱（0.46 cm×25 cm，5μm）；以乙腈-水（32∶68）為流動相；蒸發(fā)光散射檢測器；柱溫30°C；體積流量1.0 mL/min；進樣量為對照品溶液5μL，15 μL，供試品溶液20μL。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取黃芪甲苷對照品適量，加甲醇制成每1mL含500μg的對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品約1.0 g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，精密加入80%甲醇50 mL，稱定質量，加熱回流2 h，放冷，再稱定質量，用80%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液25 mL，回收溶劑至干，殘渣加水20 mL，微熱使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次20 mL，合并正丁醇液，用正丁醇飽和的氨試液充分洗滌2次，每次40 mL，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘渣用甲醇溶解并轉移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.2.4 測定方法 精密吸取對照品溶液5μL、15 μL，供試品溶液10～20μL，注入液相色譜儀，測定，以外標兩點法對數(shù)方程計算，記錄色譜圖，見圖2。

圖2 黃芪提取物中黃芪甲苷對照品 (A)、供試品 (B)、空白樣品 (C)測定的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram s of astragaloside IV(A),sam p le(B),and blank sam p le(C)

2.2.5 線性關系的考察 精密吸取對照品溶液1、2、5、10、15、20μL注入液相色譜儀，記錄峰面積，以ln進樣量 （μg）為橫坐標 （X），ln峰面積為縱坐標 （Y），繪制標準曲線，進行回歸分析，得回歸方程為Y=1.722 7X+2.155 6（r= 0.999 6）。結果表明，黃芪甲苷在 0.544μg～10.880μg范圍內進樣量的對數(shù)與峰面積的對數(shù)呈良好的線性關系。

2.2.6 精密度試驗 精密吸取黃芪甲苷對照品溶液10μL，連續(xù)進樣6次，記錄峰面積，計算得RSD為2.3%。結果表明，儀器精密度良好。

2.2.7 重復性試驗 取同一批樣品 （批號13030）6份，分別按 “2.2.3”項下供試品溶液的制備方法處理后進樣測定，計算得黃芪甲苷的RSD為3.6%，表明本方法的重復性良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗 將 “2.2.7”項下第一份供試品溶液分別于0、4、8、12、16、20、24 h進樣，記錄峰面積，計算得對照品溶液和供試品溶液RSD分別為3.0%和2.6%。結果表明對照品溶液和供試品溶液在24 h內基本穩(wěn)定。

2.2.9 加樣回收率試驗 取已測定含有量的供試品 （廣州白云山光華制藥股份有限公司，批號13030，含黃芪甲苷2.90 mg/g）0.5 g，精密稱定，一式9份，置圓底燒瓶中，再按 “2.2.3”項下供試品溶液的制備方法處理，以3份為一組，各組分別精密加入黃芪甲苷對照品溶液 （質量濃度為3 mg/mL）0.4 m L、0.5 mL、0.6 mL，分別制得低、中、高3個質量濃度水平的加樣供試品溶液各3份，進樣測定。計算得平均回收率為99.7%，RSD為1.7% （n=9）。結果見表1。

表1 黃芪甲苷加樣回收率試驗結果(n=9)Tab.1 Results of recovery tests for astragaloside IV(n=9)

2.3 毛蕊異黃酮葡萄糖苷測定

2.3.1 色譜條件 ZOBAX C18色譜柱（Agilent公司，0.46 cm×15 cm，5μm）；以乙腈為流動相A，水為流動相B，梯度洗脫 （0～25 min，5%→35%A，25～30 min，35%→80%A，30～35 min，80%A）；柱溫30°C；體積流量1.0 m L/min；檢測波長為260 nm；進樣量5μL。

2.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品適量，加甲醇制成每1 mL含20 μg的對照品溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備 取本品約1.0 g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，精密加入 50%甲醇50 m L，稱定質量，加熱回流1 h，放冷，再稱定質量，用50%甲醇補足減失的質量，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.4 測定方法 精密吸取對照品溶液和供試品溶液各5μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，見圖3。

圖3 黃芪提取物中毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品 (A)、供試品 (B)、空白樣品 (C)測定的高效液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram s of calycosin-7-glucoside(A),test sam p le(B),and blank sam p le(C)

2.3.5 線性關系的考察 取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品適量，加甲醇分別制成質量濃度為2.507 5 μg/mL、5.015μg/mL、10.03μg/mL、20.06 μg/mL、50.15μg/mL、100.30μg/mL、200.60 μg/mL的系列溶液，精密吸取系列溶液各5μL注入液相色譜儀，記錄峰面積，以質量濃度 （μg/mL）為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，進行回歸分析，得回歸方程為Y=18.254 5X+1.629 7（r=0.999 8）。結果表明，毛蕊異黃酮葡萄糖苷在2.507 5～200.60μg/mL范圍內進樣量與峰面積的對數(shù)呈良好的線性關系。

2.3.6 精密度試驗 精密吸取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品溶液 （含毛蕊異黃酮葡萄糖苷20.06 μg/mL）5μL，連續(xù)進樣6次，記錄峰面積，計算得RSD為0.3%。結果表明，儀器精密度良好。

2.3.7 重復性試驗 取同一批樣品 （批號：13030）6份，分別按 “2.3.3”項下供試品溶液的制備方法處理后進樣測定，計算得毛蕊異黃酮葡萄糖苷含有量的RSD為1.8%，表明本方法的重復性良好。

2.3.8 穩(wěn)定性試驗 將 “2.3.7”項下第一份供試品溶液分別于0、2、4、8、12、16、20、24 h進樣，記錄峰面積，計算得對照品溶液和供試品溶液RSD均為1.3%。結果表明毛蕊異黃酮葡萄糖苷在24 h內基本穩(wěn)定。

2.3.9 加樣回收率試驗 取已測定含有量的供試品 （廣州白云山光華制藥股份有限公司，批號13030，含毛蕊異黃酮葡萄糖苷0.84 mg/g）0.5 g，精密稱定，一式9份，置圓底燒瓶中，再按“2.3.3”項下供試品溶液的制備方法處理，以3份為一組，各組分別精密加入毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品溶液（質量濃度為1.003 mg/m L）0.4 m L、0.5mL、0.6mL，分別制得低、中、高3個質量濃度水平的加樣供試品溶液各3份，進樣測定。計算得平均回收率為98.0%，RSD為1.1% （n=9）。結果見表2。

表2 毛蕊異黃酮葡萄糖苷加樣回收率試驗結果 (n=9)Tab.2 Results of recovery tests for calycosin-7-glucoside (n=9)

2.4 特征圖譜 記錄 “2.3.4”項下35 min內的色譜圖。供試品特征圖譜中應呈現(xiàn)4個特征峰，與毛蕊異黃酮葡萄糖苷參照物對應的峰為S峰，計算各特征峰與S峰的相對保留時間，應在規(guī)定值的± 10%范圍之內。相對保留時間規(guī)定值為：1.35（峰1）、1.54（峰2）和1.72（峰3）。見圖4。

2.4.1 色譜條件 同“2.3.1”項。

2.4.2 對照品溶液的制備 取毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素對照品適量，加甲醇制成每1 mL含20μg的對照品溶液。

2.4.3 供試品溶液的制備 取 “2.3.3”項下的供試品溶液，即得。

圖4 HPLC對照特征圖譜Fig.4 HPLC matched chromatography for the reference fingerprint

2.4.4 重復性試驗 取 “2.3.7”項下重復性考察的樣品，進樣分析，記錄特征圖譜，結果表明各供試品溶液特征圖譜中均呈現(xiàn)4個特征峰，以毛蕊異黃酮葡萄糖苷為參照物S峰，計算各特征峰與S峰的相對保留時間，結果表明各特征峰均在規(guī)定值的±10%范圍之內。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液 （批號13030）分別于0、2、7、9、12、16、20、25 h進樣，記錄峰面積，計算得毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素的RSD分別為1.8%、2.9%、0.5%和0.5%。結果表明供試品溶液在25 h內基本穩(wěn)定。

2.4.6 耐用性試驗 由于不同廠家不同牌號的色譜柱存在填料及性能上的差異，為考察擬訂方法的可行性及通用性，對（1）Pheomenex Luna C18（Pheomenex，0.46 cm×25 cm，5μm）（2）Agilent Eclipse XDB-C18（Agilent，0.46 cm×25 cm，5 μm）（3）Waters XBridgeShieldrp18（Waters，0.46 cm×15 cm，5μm）（4）Welch Xtimate C18（月旭，0.46 cm×15 cm，5μm）4根色譜柱進行了考察，計算相對保留時間與質量標準正文規(guī)定值的偏差。結果表明，不同色譜柱得到的供試品特征色譜基本一致，相對保留時間與規(guī)定偏差均小于10%，表明擬定方法通用性較廣。

2.4.7 特征峰保留時間測定 取8批供試品溶液進樣分析，記錄特征峰的保留時間，計算相對保留時間及平均值，結果見表3。

2.5 樣品測定 取8批樣品，按供試品溶液制備方法進行制備，按上述色譜條件測定峰面積，計算，結果見表4。

3 討論

3.1 特征圖譜 黃芪中主要含有氨基酸、黃芪皂苷類與黃酮醇苷類等化合物，由于氨基酸測定方法需要衍生，步驟繁瑣、重復性差，黃芪皂苷類化合物測定需要采用蒸發(fā)光散射檢測器、靈敏度低，反應的信息量少，故上述二類化合物暫不考慮訂入特征圖譜，故本研究重點在于黃酮醇苷類化合物的特征圖譜研究，主要針對報道中的幾種化合物，建立特征圖譜。除文中提到的幾種化合物外，8批樣品在4～10 min保留時間內有部分共有峰，但此類化合物由于極性較低，在不同品牌色譜柱上峰形不一致，保留時間差別也較大，另外此部分色譜峰峰面積較小，考慮暫不將此類色譜峰訂入質量標準，有待進行進一步的物質基礎研究，明確物質基礎后，再行將相關化合物訂入特征圖譜。

表3 特征圖譜中4種成分相對保留時間Tab.3 Relative retention time of 4 components in characteristic spectria

表4 樣品測定結果Tab.4 Test results of sam p les

3.2 黃芪甲苷測定研究

3.2.1 黃芪甲苷提取方式的考察 本實驗考察了50%甲醇、甲醇超聲30 min或加熱回流30 min時的提取效率，結果表明采用不同溶劑時，加熱回流的提取效率均高于超聲提取，故選擇回流提取作為供試品的提取方式。

3.2.2 黃芪甲苷提取溶劑的考察 本實驗考察了采用水、30%甲醇、50%甲醇、80%甲醇及甲醇等不同溶劑的回流提取，結果表明以80%甲醇作為提取溶劑時，黃芪甲苷的提取效率最高，故選擇80%甲醇作為提取溶劑。

3.2.3 黃芪甲苷回流時間的考察 本實驗考察了0.5、1、2、3、4 h不同加熱回流時間下，黃芪甲苷的提取效率。結果表明隨回流時間的延長，黃芪甲苷的提取效率呈增加趨勢，增大至一定數(shù)值后基本穩(wěn)定，回流2 h可基本提取完全，故確定加熱回流時間為2 h。

3.2.4 黃芪甲苷提取和洗滌次數(shù)的考察 本實驗考察了正丁醇提取次數(shù)及氨試液洗滌次數(shù)對測定的影響，結果表明采用水飽和正丁醇提取4次、氨試液洗滌2次時，即可達到理想的提取凈化效果。

3.3 毛蕊異黃酮葡萄糖苷測定研究

3.3.1 毛蕊異黃酮葡萄糖苷提取溶劑的考察 本實驗考察了采用水、30%甲醇、50%甲醇、80%甲醇等不同溶劑的回流提取，結果表明以50%甲醇作為提取溶劑時，毛蕊異黃酮葡萄糖苷的提取效率最高，故選擇50%甲醇作為提取溶劑。

3.3.2 毛蕊異黃酮葡萄糖苷回流時間的考察 本實驗考察了0.5、1、1.5、2 h不同加熱回流時間下，毛蕊異黃酮葡萄糖苷的提取效率。結果表明隨回流1 h即可完全提取出毛蕊異黃酮葡萄糖苷，故確定提取時間為1 h。

［1］張 薔，高文遠，滿淑麗.黃芪中有效成分藥理活性的研究進展［J］.中國中藥雜志，2012，37（21）：3203-3207.

［2］王春怡，葉雪蘭，李衛(wèi)民，等.黃芪總皂苷提取物的質量標準研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2012，23（1）：94-96.

［3］陳國輝，黃文鳳.黃芪的化學成分及藥理作用研究進展［J］.中國新藥雜志，2008，17（17）：1482-1485.

［4］劉浩文，劉嘉儀，楊妙榮，等.黃芪藥材中黃芪甲苷含量測定的兩種方法的比較研究［J］.中國新藥與臨床藥理，2011，22（6）：659-662.

［5］何 娟，何秀英.黃芪四物湯顆粒的質量標準研究［J］.中國中醫(yī)藥科技，2009，16（3）：217-219.

［6］WS3-B-3667-98，衛(wèi)生部藥品標準：中藥成方制劑第19冊［S］.

［7］何選林，王群英.RP-HPLC測定腦絡通膠囊中原兒茶醛、阿魏酸、丹參酮IIA和鹽酸托哌酮的含量［J］.中成藥，2011，33（1）：61-65.

［8］黃 松，陶 艷，蔣東旭，等.腦絡通膠囊質量標準的完善［J］.中國藥師，2008，11（2）：142-145.

［9］姚雪蓮，裴彩云，王宗權.不同產(chǎn)地、不同采收期黃芪藥材及飲片中毛蕊異黃酮葡萄糖苷及芒柄花素含量測定［J］.藥物分析雜志，2012，32（5）：797-805.

［10］覃潔萍，姚 蓉，李 蕓，等.HPLC-ELSD同時測定復方扶芳藤膠囊中衛(wèi)矛醇和黃芪甲苷的含量［J］.中成藥，2008，30（10）：1468-1471.

［11］胡芳弟，趙健雄，封士蘭，等.黃芪的高效液相色譜指紋圖譜及主成分含量測定［J］.中藥材，2004，27（11）：831-834.

［12］查建蓬，張嫡群，王云志.黃芪及其制劑質量控制方法研究進展［J］.中成藥，2006，28（6）：875-878.

［13］熊澤，徐紅霞，偉邵，等.養(yǎng)榮丸 （濃縮丸）質量標準研究［J］.中成藥，2010，32（6）：1070-1073.

［14］宋成英，封加福.HPLC同時測定黃芪藥材中毛蕊異黃酮葡萄糖苷和黃芪甲苷［J］.中國實驗方劑學雜志，2013，19（11）：115-117.

［15］黃志勤，李洪亮，程齊來.HPLC測定黃芪藥材中的毛蕊異黃酮葡萄糖苷［J］.光譜實驗室，2012，29（5）：2736-2738.

［16］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：2010年版一部［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：283.

［17］梁 瑾，劉小花，遠 任，等.黃芪藥材的HPLC-DADELSD指紋圖譜研究［J］.中國實驗方劑學雜志，2012，18（7）：70-74.

［18］黃月純，尹 雪，魏 剛.玉屏風湯劑的HPLC指紋圖譜研究［J］.中成藥，2008，30（10）：1405-1408.

［19］張慶芝，吳曉俊，劉 滌，等.黃芪及其民間習用品DNA指紋圖譜和有效成分含量的比較［J］.中國藥學雜志，2005，40（6）：457-459.

Quality standard for Astragali Radix aqueous extract

NIE Jing1，2， MIAO Shui2， LIWen-ting2， MAO Xiu-hong2， JIShen2*
（1.Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry，Shanghai200040，China；2.Shanghai Institute for Food and Drug Control，Shanghai 201203，China）

AIMTo establish the quality standard for Astragali Radix aqueous extract.M ETHODSTLC was adopted for the qualitative identification of astragaloside IV.HPLCwas used to determine the contents of astragaloside IV and calycosin-7-glucoside.RESULTSTLC spotswere clear and well separated without interference. The compounds showed a good linearity（r＞0.999）in a determination range.The average recovery was between 97.5%-100.5%.CONCLUSIONThe method can repeat itself on four columns，including Pheomenex Luna C18（0.46 cm×25 cm，5μm），Agilent Eclipse XDB-C18（0.46 cm×25 cm，5μm），Waters XBridgeShieldrp18（0.46 cm×15 cm，5μm），and Welch Xtimate C18（0.46 cm×15 cm，5μm）with good precision and accuracy.

Astragali Radix aqueous extract；astragaloside IV；calycosin-7-glucoside；TLC；HPLC

R927.2

：A

：1001-1528（2015）07-1471-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.07.017

2015-02-09

聶 晶（1989—），女，碩士生。E-mail：jingxin1205@126.com

*通信作者：季 申 （1968—），女，博士生導師，從事中藥質量標準及中藥安全性研究。Tel：（021）50798196，E-mail：jishen2013 @163.com