葛 斌，楊智敏，路 健，楊名慧

（遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院生殖中心，貴州遵義563003）

重度畸形精子癥患者精核蛋白表達(dá)的研究

葛 斌，楊智敏，路 健，楊名慧

（遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院生殖中心，貴州遵義563003）

目的研究重度畸形精子癥患者精核蛋白（TNBP）含量及表達(dá)差異，為臨床治療提供理論基礎(chǔ)。方法2013年2月至2014年5月提取23例重度畸形精子癥患者（重度畸精組）和37例健康男性（對(duì)照組）的精液TNBP，在聚丙酰胺凝膠中電泳，經(jīng)微顯像測(cè)密儀掃描以測(cè)定各蛋白條帶的相對(duì)含量。結(jié)果重度畸精組總組蛋白/總堿性蛋白（TH/TP）、1型精核蛋白/2型精核蛋白（TNBP1/TNBP2）、TP/TNBP2值顯著高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而TNBP1/ TP值與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；精子密度顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；精液活率、前向運(yùn)動(dòng)率與對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論TNBP的相對(duì)含量中TNBP1/TNBP2和TP/TNBP2比值異常是導(dǎo)致重度畸精癥的原因之一。

精子； 先天畸形； 基因表達(dá)； 重度畸精癥； 精核蛋白

目前，男性不育發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，近20年來(lái)人類精子數(shù)量平均每年以2%的速度下降。不育不僅影響患者的身心健康，而且還會(huì)帶來(lái)一些社會(huì)問題，因此，男性不育癥的研究已經(jīng)引起全世界的高度重視[1]。最近研究發(fā)現(xiàn)，精子組蛋白-精核蛋白取代反應(yīng)（HPRR）和精核蛋白（TNBP）的表達(dá)異常與男性不育有密切關(guān)系[2]。精子總堿性核蛋白，即TNBP有2種亞型：1型精核蛋白（TNBP1）和2型精核蛋白（TNBP2），所有哺乳動(dòng)物精子內(nèi)均有TNBP1，而TNBP2僅存在于人類、馬和小鼠等少數(shù)哺乳動(dòng)物體內(nèi)。TNBP2的表達(dá)量與人類睪丸內(nèi)精子數(shù)量密切相關(guān)[2]，也有學(xué)者認(rèn)為，TNBP1/TNBP2值相對(duì)于TNBP總量更能反映出人類精子質(zhì)量[3]。

畸形精子癥（畸精癥）是引起男性不育的主要原因之一，指正常形態(tài)的精子數(shù)占總精子數(shù)的比例小于4%，而小于1%為重度畸精癥。重度畸精癥的病因很復(fù)雜，其中染色體異常和DNA損傷是導(dǎo)致畸精癥的主要原因之一[4]，最近黃茜等[5]研究發(fā)現(xiàn)，畸精癥患者DNA完整性顯著高于健康者。Harbuz等[6]認(rèn)為，TNBP1基因SNP位點(diǎn)-190c-＞A多態(tài)性是引起重度畸精癥的重要原因之一，該位點(diǎn)多態(tài)性通過調(diào)節(jié)TNBP1的表達(dá)量來(lái)影響畸形精子的比例[7]。本研究以此為切入點(diǎn)，探討TNTP表達(dá)差異與重度畸精癥的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年2月至2014年5月到本中心男科實(shí)驗(yàn)室行精液質(zhì)量分析的患者23例，均為原發(fā)不育1年以上的重度畸精癥患者（重度畸精組），平均年齡（33.2±4.7）歲，正常形態(tài)精子小于1%，排除染色體異常、精索靜脈曲張等疾病。另選取有健康生育史男性37例為對(duì)照組，平均年齡（31.7±5.2）歲，正常形態(tài)精子大于或等于4%。

1.2 方法 兩組研究對(duì)象禁欲2～7 d，用手淫方法取出精液至廣口杯內(nèi)，于37℃恒溫水浴箱內(nèi)液化30 min。使用偉力全自動(dòng)精子分析軟件測(cè)定精液密度、活率和前向運(yùn)動(dòng)精子率，形態(tài)檢查使用德國(guó)WALDECK公司生產(chǎn)的Testsimplets染色玻片，染色后于油鏡下計(jì)數(shù)200個(gè)精子，計(jì)算出畸精率，各參數(shù)均參照WHO男科學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.1 提取TNBP 用高低密度洗滌液洗滌精子，離心（2 000 r/min）10 min，并調(diào)整精子密度為20×106mL-1，精液樣本用生理鹽水洗滌2次后離心（1 800 r/min）5 min，將精子沉淀溶于少量5 mol/L鹽酸胍溶液，使核解聚，隨后加入1 mol/L鹽酸溶液至終濃度為0.25 mol/L，冰浴20 min后離心（1 000 r/min）15 min，分離上清液。沉淀物再用0.25 mol/L鹽酸溶液重復(fù)抽提1次，合并2次上清液。在上清液內(nèi)加入60%三氯醋酸，使終濃度為20%，冰浴25 min后離心（1 000 r/min）15 min，沉淀物用冷丙酮洗滌后離心（1 000 r/min）15 min，最后將提取的TNBP真空干燥。

1.2.2 總堿性蛋白（TP）及蛋白含量測(cè)定 在TP的丙酮干粉中加入0.2 mL蛋白溶解液、60%三氯乙酸，混合后冰浴20 min，在400 nm處比色后計(jì)算TP含量。TP中各蛋白含量測(cè)定采用Panylm-Chalkley法在聚丙酰胺凝膠中電泳，電泳膠用0.1%氨基黑染色脫色后拍攝成照片，用掃描儀掃描各蛋白條帶，測(cè)定各蛋白含量，用總組蛋白（TH）/TP和TNBP1/TNBP2值表示TNBP的相對(duì)含量。

1.2.3 觀察指標(biāo) 觀察記錄兩組研究對(duì)象TNBP相對(duì)含量（TH/TP、TNBP1/TNBP2、TP/TNBP2、TNBP1/TP平均值）及精液質(zhì)量參數(shù)（精子密度、活率、前向運(yùn)動(dòng)率）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組研究對(duì)象TNBP相對(duì)含量比較 重度畸精組患者TH/TP、TNBP1/TNBP2、TP/TNBP2平均值明顯較對(duì)照組高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而TNBP1/TP平均值與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

2.2 兩組研究對(duì)象精液質(zhì)量參數(shù)比較 對(duì)照組研究對(duì)象的平均精子密度明顯高于重度畸精組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而精子活率、前向運(yùn)動(dòng)率與重度畸精組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表1 兩組研究對(duì)象TNBP相對(duì)含量比較（±s）

表1 兩組研究對(duì)象TNBP相對(duì)含量比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05。

組別對(duì)照組重度畸精組n TH/TP TNBP1/TNBP2 TP/TNBP2 TNBP1/TP 37 23 0.20±0.04 2.92±1.57a0.93±0.10 2.26±0.96a2.25±0.41 4.64±1.93a0.25±0.06 0.28±0.03

表2 兩組研究對(duì)象精液質(zhì)量參數(shù)比較（±s）

表2 兩組研究對(duì)象精液質(zhì)量參數(shù)比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05。

組別對(duì)照組重度畸精組n 精子密度（×106mL-1） 活率（%） 前向運(yùn)動(dòng)率（%）66.83±14.26 8.29±2.91a37 23 55.22±19.87 60.16±21.43 45.43±17.69 47.35±16.51

3 討 論

精子形態(tài)受多種因素影響，精液白細(xì)胞、重金屬和微量元素濃度增加、空氣污染、工作環(huán)境、卵泡生成激素水平和基因突變均可能導(dǎo)致畸精癥[8-10]。精液中白細(xì)胞釋放的活性氧等活性產(chǎn)物可介導(dǎo)精子膜脂質(zhì)過氧化，破壞精子內(nèi)部結(jié)構(gòu)；工作環(huán)境對(duì)精液形態(tài)也有明顯影響，本中心以往研究發(fā)現(xiàn)，從事電焊、裝修和釀酒等職業(yè)者精子正常形態(tài)率顯著下降，尾部卷曲精子率明顯升高；基因異常也是引起重度畸精癥的主要原因之一，目前發(fā)現(xiàn)的重度畸精癥相關(guān)基因有透明帶結(jié)合蛋白基因、精子成熟蛋白基因、過度蛋白基因和TNBP基因等[5]。精子形態(tài)異常包括頭部異常、頸部異常、尾部異常和細(xì)胞質(zhì)小滴等，以頭部異常最為常見，表現(xiàn)形式為梨形頭、不定形頭和頂體缺失等，畸形精子經(jīng)常出現(xiàn)頂體與核膜分離、雙層膜結(jié)構(gòu)部分或全部消失、頂體反轉(zhuǎn)等現(xiàn)象，所以當(dāng)精子形態(tài)異常時(shí)，就會(huì)影響到精子表面的糖基結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)，精子附著于卵細(xì)胞透明帶能力下降，使精子與卵子的頂體-透明帶反應(yīng)發(fā)生障礙，從而精子無(wú)法穿透卵子透明帶和質(zhì)膜與卵子結(jié)合受精[11]。

人類精子細(xì)胞發(fā)育過程中，TNBP逐漸取代組蛋白與DNA結(jié)合構(gòu)成精子染色質(zhì)，這一現(xiàn)象稱為HPRR，因此，TNBP是成熟精子內(nèi)TP的主要組成部分，TNBP相對(duì)于TH更容易與DNA結(jié)合，它使細(xì)胞核高度濃縮，促進(jìn)精子細(xì)胞由圓形變成長(zhǎng)形，最終分化為成熟精子，對(duì)維持精子細(xì)胞核穩(wěn)定有重要意義[12]，因此TNBP表達(dá)差異直接影響男性生育能力。TNBP2僅存在與人類等極少數(shù)哺乳動(dòng)物中，研究發(fā)現(xiàn)，TNBP2的表達(dá)量和TNBP2/ TNBP1值與精子密度、活率密切相關(guān)[2]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重度畸精組患者TNBP表達(dá)總量明顯高于對(duì)照組，說明該類型患者存在HPRR障礙，而TNBP1/TNBP2值稍高于對(duì)照組，顯示TNBP表達(dá)量的下降主要表現(xiàn)為TNBP2表達(dá)量的減低。由此可知，TNBP表達(dá)差異與精子形態(tài)異常存在相關(guān)性。

少精癥、弱精癥和畸精癥是男性不育的主要表現(xiàn)形式，這3種情況經(jīng)常在單個(gè)個(gè)體中同時(shí)發(fā)生，作者以前的研究也證實(shí)了這一點(diǎn)[13]。本次研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重度畸精組患者的精子密度顯著低于對(duì)照組，但是活率和前向運(yùn)動(dòng)率與對(duì)照組無(wú)明顯差異，這與作者以前的研究結(jié)果[13]不同，分析原因應(yīng)該是樣本量較少所致（上次樣本總量為386例，此次僅為60例）。

目前，治療重度畸精癥的主要方法是卵胞漿內(nèi)單精子注射，此方法不但成本昂貴且增加了遺傳病垂直傳遞給子代的風(fēng)險(xiǎn)，因此，尋找安全、有效、成本低的方法治療重度畸精癥已成為最近比較熱門的研究。有學(xué)者采用中成藥治療男性少、弱、畸精癥已初見成效[10]。本研究初步探討了重度畸精癥患者TNBP的表達(dá)差異，有望對(duì)重度畸精癥的臨床治療提供理論基礎(chǔ)。

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Protamine expression in severe teratozoospermia patients

Ge Bin，Yang Zhimin，Lu Jian，Yang Minghui
（Reproductive Center，Affiliated Hospital of Zunyi Medical College，Guizhou，Zunyi 563003，China）

ObjectiveTo investigate the difference of content and expression of protamine（TNBP）in the severe teratozoospermia patients and provide the theoretical basis.MethodsIt was extracted TNBP of semen protamine from 23 severe teratozoospermia patients（the severe teratozoospermia group）and 37 healthy men（the control group）from Feruary 2013 to May 2014 with polyacrylamide gelelectrophoresis and then confirm the relative content of proein bands scanned by micro imaging density measuring instrument under the cataphoresis in the polyacrylamide hydrogel.ResultsThe value of TH/TP，TNBP1/TNBP2，TP/ TNBP2 in the evere teratozoospermia group were significantly higher than those of the control group（P＜0.05）.Compared with the control group，there was no significant difference in TNBP1/TP value（P＞0.05）.Thesperm density was lower than that of the control group（P＜0.05）.Both the sperm survival rate and the precession movement rate showed no significant difference with the control group（P＞0.05）.ConclusionThe abnormity of TNBP1/TNBP2，TP/TNBP2 in the relative content of TNBP is one of the reasons leading to severe teratozoospermia.

Spermatozoa； Congenital abnormalities； Gene expression； Severe abnormal azoospermia； Protamine

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.06.007

：A

：1009-5519（2015）06-0818-02

2014-10-29）

遵義醫(yī)學(xué)院碩士啟動(dòng)基金（院字2007-54號(hào)）。

葛斌（1981-），男，安徽渦陽(yáng)人，碩士研究生，主要從事分子遺傳學(xué)方面的研究；E-mail：38248866@qq.com。