鄧方閣 王 靜 周大治 江 梅 鄭 俠 吳賢生 黃 威 周志彪

(1廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院廣州呼吸疾病研究所呼吸疾病國家重點實驗室，廣東廣州510120;2廣州醫(yī)科大學臨床醫(yī)學2010級南山班，廣東 廣州510120;3廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院超聲科，廣東廣州510120;4廣東省醫(yī)學實驗動物中心，廣東佛山528248)

深靜脈血栓形成(deep venous thrombosis，DVT)是最為常見和最為重要的一類具有潛在致死性疾病，預計發(fā)病率為每年0.6‰［1］，美國每年診斷DVT病例超過100萬［2］，各種疾病死亡患者中，有DVT者占尸檢的72%［3］。經(jīng)典理論認為DVT形成的三要素為:血流緩慢、血管壁損傷、血液高凝狀態(tài)［4］。然而，近年研究發(fā)現(xiàn)感染和炎癥是誘發(fā)血栓性疾病急性發(fā)作的重要危險因素［5］。因此，本文通過對新西蘭白兔股靜脈局部單純注射脂多糖來構(gòu)建股靜脈血栓形成，進一步證實炎癥在靜脈血栓形成中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

普通級健康新西蘭大白兔共9只，均為雄性，體質(zhì)量約2.0～2.5 kg，由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供，單籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)期間給兔顆粒飼料，自由飲水，術前適應性飼養(yǎng)2周。

所有實驗兔(9只)均采用自身對照研究，均以左側(cè)股靜脈為實驗組，右側(cè)股靜脈為對照組。實驗組除分離股靜脈外，還在股靜脈單純注射脂多糖稀釋液;而對照組則只進行股靜脈分離，不注射脂多糖稀釋液。此外，根據(jù)兔是否固定外科小夾板，分為小夾板固定組(5只)和非固定組(4只)兩個亞組。

1.2 模型制備

3%戊巴比妥鈉按1 mL/kg沿耳緣靜脈注射，兔全麻麻醉后仰臥位固定，股三角區(qū)和腹股溝區(qū)剃毛暴露表皮，在一側(cè)腹股溝下方沿股動脈搏動最強處作一自內(nèi)上至外下的一長約3 cm的斜形切口，逐層切開皮膚并純性分離腹外斜肌，游離股動脈、股靜脈和股神經(jīng)，顯微血管夾局部橫行完全阻滯股靜脈近心端血流。取0.1 mL的脂多糖稀釋液(Sigma，終濃度為50μg/mL)注入血管夾阻滯的股靜脈內(nèi);再繼續(xù)留觀30 min后，去血管夾，逐層縫合皮膚，5只兔用小夾板固定，4只兔放回籠中，繼續(xù)飼養(yǎng)72 h。模型制備后每天繼續(xù)觀察實驗兔的一般狀態(tài)并記錄。另一側(cè)為對照側(cè)即只進行手術切開、分離股血管和縫合表皮。72 h后進行血管加壓超聲檢測血栓形成，檢測結(jié)束后，戊巴比妥鈉處死實驗兔，并對雙側(cè)股靜脈迅速取材進行病理學檢測。

1.3 病理學檢查

每天觀察兔體表大體形態(tài)變化。在術后72 h，在血管加壓超聲檢測結(jié)束后，處死實驗兔，并迅速取雙側(cè)實驗段股靜脈，4%多聚甲醛固定，HE染色，進行病理學檢測。

1.4 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)均用SPSS 13.0處理，計數(shù)資料采用率表示，固定組和非固定組血栓形成模型成功率的比較用Fisher’s Exact test檢驗，當P＜0.05認為差異沒有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般狀態(tài)觀察

8只兔存活，固定組1只兔于60h后死于雙側(cè)DVT、肺栓塞;實驗兔的精神狀態(tài)尚可，固定組實驗兔下肢活動受限，非固定組實驗兔活動自由，所有兔均未見明顯的皮膚顏色變化和腫脹。

2.2 血管加壓超聲檢測

8只兔的實驗側(cè)股靜脈均見血栓形成，而對照側(cè)均未見明顯血栓形成;1只兔的實驗側(cè)和對照側(cè)的股靜脈均未見明顯血栓形成。

2.3 病理學檢查

病理學HE染色顯示所有兔的實驗側(cè)股靜脈管壁均有不同程度的增厚和炎細胞浸潤，除固定組1只兔未形成血栓形成外，8只兔實驗側(cè)均可見明顯的血栓形成。而對照側(cè)股靜脈僅部分血管管壁輕度增厚，但均未見血栓形成及炎細胞浸潤，見圖1。

圖1 股靜脈的病理檢測(HE染色 ×100)

2.4 固定組和非固定組血栓形成模型成功率的比較

固定組5只兔中有4只有血栓形成(80%)，非固定組4只兔均有血栓形成(100%)，兩組相比，P=1.000，差異沒有統(tǒng)計學意義。

3 討論

與動脈硬化性疾病相似，靜脈血栓形成也是一種炎癥反應過程。血栓與炎癥反應密切相關，并形成級聯(lián)放大效應，尤其是血栓與炎癥急性期反應相關［6－7］。炎癥反應過程中多種炎癥介質(zhì)導致血管擴張、血管通透性增高;白細胞募集、活化以及發(fā)熱、疼痛、組織損傷等病理生理變化，最終引起血管內(nèi)皮損傷［6－7］。血管內(nèi)皮損傷是靜脈血栓形成的重要條件之一。內(nèi)皮細胞損傷暴露出內(nèi)皮下的膠原，激活血小板和凝血因子XII，啟動了內(nèi)源性凝血過程;內(nèi)皮細胞本身具有促血凝作用，能合成組織因子，存在于內(nèi)皮細胞內(nèi)，當內(nèi)皮細胞損傷時得以釋出激活凝血因子VII，從而啟動了外源性凝血過程。

脂多糖是革蘭氏陰性菌細胞壁的重要組成成分，是存在于細菌、衣原體等上的致炎活性成分，脂多糖的釋放可誘發(fā)炎癥反應，并導致血管內(nèi)皮損傷［8］。脂多糖可刺激血管內(nèi)皮細胞釋放黏附因子趨化炎細胞，促進單核細胞合成和釋放白細胞介素 1、白細胞介素 6 和腫瘤壞死因子 α 等［8－9］，這些炎性因子誘導組織因子表達，相互作用，導致病理性血栓形成。股靜脈栓塞模型制作通常采用結(jié)扎股靜脈、注射凝血酶或骨折等方式造模，而本實驗僅僅是通過在實驗側(cè)單純注射脂多糖即形成明顯栓塞，證實炎癥在栓塞形成中的作用。此外，本實驗采用自身對照，對所有兔的雙側(cè)股靜脈均進行了手術，主要是為了排除因手術操作可能導致炎癥對實驗的影響。

內(nèi)科疾患長期臥床者、制動、手術后等因素是誘發(fā)DVT形成的高危因素，因此，本實驗又分為固定和非固定2個亞組，然而，在本實驗中，2組間并無明顯差異，這主要是由于設置夾板固定和非固定組的樣本量偏小，只能進一步說明炎癥是致使血栓形成的最直接原因，還尚不能得出是否夾板固定導致的制動是高危因素的結(jié)論，這也是本實驗的局限性，還需加大樣本量進行深一步的研究。

［1］Kreidy R，Irani－Hakime N.Is thrombophilia a major risk factor for deep vein thrombosis of the lower extremities among Lebanese patients［J］.Vasc Health Risk Manag，2009，5:627－633.

［2］de Oliveira A，F(xiàn)ran?a GJ，Vidal EA，et al.Duplex scan in patients with clinical suspicion of deep venous thrombosis［J］.Cardiovasc Ultrasound，2008，6:53.

［3］ Aqulia AM.Deep Venous thrombosis［J］.J Cardiovasc Nurs，2001，15(4):25－44.

［4］Torbicki A，Perrier A，Konstantinides S，et al.Guidelines on the diagnosis and management of acute pulmonary embolism:the Task Force for the Diagnosis and Management of Acute Pulmonary Embolism of the European Society of Cardiology(ESC)［J］.Eur Heart J，2008，29(18):2276－315.

［5］Pussinen PJ，Tuomisto K，Jousilahti P，et al.Endotoxemia，immune response to periodontal pathogens，and systemic inflammation associate with incident cardiovascular disease events［J］.Arterioscl Thromb Vascul Biol，2007，27(6):1433－1439.

［6］Hald EM，Brakkan SK，Mathiesen EB，et al.Highsensitivity C－reactive protein is not a risk factor for venous thromboembolism:the Tromso study［J］.Haematologica，2011，96(8):1189－1194.

［7］ Folsom AR，Lutsey PL，Astor BC，et al.C－reactive protein and venous thromboembolism:a prospective investigation in the ARIC cohort［J］.Thromb Haemost，2009，102(4):615－619.

［8］Juskewitch JE，Knudsen BE，Platt JL，et al.Systemic inflammation is driven by parenchymal cell activation and exclusively predicted by early MCP－1 plasma levels［J］.Am JPathol，2012，180(1):32－40.

［9］Seehase S，Lauenstein HD，Schlumbohm C，et al.LPS－induced lung inflammation in marmoset monkeys－an acute model for anti－inflammatory drug testing［J］.PLUS One，2012，7(8):e43709.