劉云婷，徐 巍，辛 毅，李新莉

大連醫(yī)科大學(xué)生物技術(shù)系，大連 116044

人體腸道中存在著大量微生物，其中超過99%都是細(xì)菌，人體的健康程度與腸道菌群結(jié)構(gòu)息息相關(guān)。在長期的進(jìn)化過程中，腸道菌群經(jīng)過個體的適應(yīng)和自然選擇，菌群中不同種類之間，菌群與宿主之間，菌群、宿主與環(huán)境之間，始終處于一種動態(tài)平衡狀態(tài)中，形成了一個互相依存，相互制約的系統(tǒng)。因此，人體在正常情況下，菌群結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定，對宿主表現(xiàn)為不致病，而一旦打破了這種平衡，就有可能產(chǎn)生腹瀉、陰道感染、人體免疫力降低、血清膽固醇增高甚至提高了癌癥和腫瘤的發(fā)生率［1］。在食品中添加益生元成為解決這一問題的重要途徑［2］。枸杞子(Fructus Lycii)是茄科植物枸杞的干燥成熟果實，素有“紅寶”之稱，含有枸杞多糖、甜菜堿、核黃素、甾醇、蕓香苷和枸杞葉蛋白等有效成分以及多種氨基酸和微量元素［3］，具有滋補(bǔ)肝腎，益精明目的功效，是歷代醫(yī)藥學(xué)家推崇的上等滋補(bǔ)珍品。近年來用現(xiàn)代醫(yī)藥學(xué)的手段對枸杞子的研究日漸活躍，證明了枸杞子對人體具有多種有益作用和療效［4］。本實驗考察了不同濃度枸杞子提取物對抗生素相關(guān)性菌群失衡小鼠的調(diào)整作用，檢測小鼠糞便主要優(yōu)勢菌數(shù)量的變化，以明確枸杞子是否可以成為新一代的益生元，為其進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

UVS-1 渦旋振蕩器(北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司);HC-3018R 高速冷凍離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)有限公司);BCM 潔凈操作臺(蘇州真田潔凈設(shè)備有限公司);HPX-9052MBE 電熱恒溫培養(yǎng)箱(常州諾基儀器有限公司);高壓蒸汽滅菌鍋(創(chuàng)博環(huán)球生物科技有限公司);恒溫水浴鍋(金壇市華特實驗儀器有限公司)。

1.2 試藥

枸杞子(銀川寧杞紅土特產(chǎn)有限公司);頭孢拉定膠囊(長春迪瑞制藥有限公司，批號:H20063308，規(guī)格:每粒0.25 g);LBS 培養(yǎng)基(乳酸桿菌選擇培養(yǎng)基)、BS 培養(yǎng)基(雙歧桿菌選擇培養(yǎng)基)、EMB 培養(yǎng)基(腸桿菌選擇培養(yǎng)基)、EC 培養(yǎng)基(腸球菌選擇培養(yǎng)基)、胰蛋白胨(青島海博生物技術(shù)有限公司);酵母提取物(OXIOD，進(jìn)口分裝);瓊脂粉(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司);氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等均為分析純(上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.3 動物

SPF 級BALB/c 小鼠，雌雄各半，體重18～22 g，由大連醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，動物合格證號:SCXK(遼)2008-0002。

2 實驗方法

2.1 枸杞子提取物的制備

稱取干燥枸杞子100 g，加水1 L 浸泡1 h，煎煮1 h，過濾，濾渣加同量水再煎一次，合并濾液蒸發(fā)濃縮至250 mL，生藥濃度為0.4 g/mL。

2.2 藥品配制

頭孢拉定用蒸餾水配制成10 mg/mL。以生藥濃度為0.4 g/mL 的枸杞子溶液為高濃度提取物。取10 mL 枸杞子高濃度提取物加入10 mL 蒸餾水，配置生藥濃度為0.2 g/mL 的枸杞子低濃度提取物。

2.3 分組與處理

動物給藥劑量參照公式dB=dA× (KB/KA)。其中，dA(dB)為A(B)種動物每千克體重給藥劑量;KA(KB)為A(B)種動物的折算系數(shù)。

40 只小鼠隨機(jī)分為5 組:正常對照組(N)、枸杞子提取物高濃度組(H)、低濃度組(L)、模型組(C)和自然恢復(fù)組(R)，每組8 只。除正常對照組外，其他組均灌服10 mg/mL 頭孢拉定溶液7 d，0.2 mL/d 建立腸道菌群失調(diào)模型。第8 d 分別用0.4 g/mL 枸杞子提取物、0.2 g/mL 枸杞子提取物、10 mg/mL 頭孢拉定溶液、蒸餾水以0.2 mL/d 持續(xù)灌胃7 d。分別在實驗的0、7、14 d 收取每只小鼠糞便，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 腸道菌群檢測

2.4.1 標(biāo)本處理

取小鼠糞便0.2 g 于無菌試管(編號1)，加入1.8 mL 無菌PBS 溶液(pH 7.4)，混勻至糞便均質(zhì)化，此為10 倍稀釋。取7 個無菌試管(編號為2～8)，各加入4.5 mL 無菌PBS 溶液，然后從管1 中取出0.5 mL 糞便均質(zhì)化溶液，放入管2，充分混勻，即為100 倍稀釋，依次進(jìn)行倍比稀釋，至108倍稀釋備用。

2.4.2 標(biāo)本滴種

嚴(yán)格按說明書要求，配制LBS、BS、EMB、EC 培養(yǎng)基，115 ℃高壓滅菌15 min，趁熱灌注平板，冷卻后，從高稀釋度開始(見2.4.1)，每次吸取20 μL 菌液滴種于各平皿上，滴種結(jié)束后，用涂布棒將液體涂勻。每個稀釋倍數(shù)重復(fù)3 次。EMB 和EC 培養(yǎng)基倒置，37 ℃培養(yǎng)24 h 后觀察結(jié)果;BS 培養(yǎng)基用厭氧罐法培養(yǎng)24 h 后觀察結(jié)果;LBS 培養(yǎng)基用厭氧罐法培養(yǎng)46 h 后觀察結(jié)果。

2.4.3 活菌計數(shù)

對菌落個數(shù)為10～100 的平板進(jìn)行計數(shù)［5］，結(jié)果以lg cfu/g 的形式表示(見表1)。

2.5 數(shù)據(jù)分析

3 實驗結(jié)果

如表1 所示。灌服頭孢拉定后腸道各細(xì)菌與正常對照組相比均有顯著性變化(a)，提示建模成功。使用不同濃度的枸杞子提取物對腸道菌群失調(diào)小鼠進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示枸杞子提取物(H 和L)能夠促進(jìn)菌群失調(diào)小鼠腸道內(nèi)腸桿菌的生長(b);針對乳酸桿菌和雙歧桿菌的促生長作用更加顯著(c)，枸杞子提取物的作用均明顯優(yōu)于自然恢復(fù)組(d)，且低濃度對二細(xì)菌的增殖作用高于高濃度;而對腸球菌的促生效果不明顯。由上可知，枸杞子提取對乳酸桿菌和雙歧桿菌生長促進(jìn)作用明顯。

表1 各組糞便標(biāo)本菌群檢測結(jié)果(，lg cfu/g)Table 1 Detection of bacteria in stool samples(，lg cfu/g)

表1 各組糞便標(biāo)本菌群檢測結(jié)果(，lg cfu/g)Table 1 Detection of bacteria in stool samples(，lg cfu/g)

注:a:與正常對照組相比，＊＊P＜0.01;b:與模型組相比，* P＜0.05;c:與模型組相比，＊＊P＜0.01;d:與自然恢復(fù)組相比，＊＊P＜0.01。Note:a:Compare with control，＊＊P＜0.01;b:Compare with Model group，* P＜0.05;c:Compare with Model group，＊＊P＜0.01;d:Compare with spontaneous recovery group，＊＊P＜0.01.

4 討論

抗生素是臨床治療感染性疾病的主要藥物，但長期使用會導(dǎo)致腸道微生態(tài)失調(diào)，造成臨床伴發(fā)性腹瀉，引起二重感染癥狀，給治療帶來困難［6］。益生元在人體內(nèi)不消化或難消化，通過促進(jìn)腸道內(nèi)雙歧桿菌、乳酸桿菌等益生菌的增殖而起到改善腸道菌群環(huán)境的作用［7］，對宿主的健康具有促進(jìn)作用。大量文獻(xiàn)表明［8，9］，中藥作為益生元能夠促進(jìn)腸道正常有益菌群的生長，維護(hù)機(jī)體微生態(tài)平衡。

腸道菌群可分為深層的緊貼黏膜表面的膜菌群，主要由雙歧桿菌和乳酸桿菌等共生厭氧菌組成;中層為糞桿菌、消化鏈球菌等厭氧菌;表層的細(xì)菌可游動，稱腔菌群，主要是腸桿菌、腸球菌等需氧菌［10］。研究表明若能增加腸道益生菌的比例，抑制有害菌的繁殖，就可以減少腸道腐敗、清潔腸道、促進(jìn)健康、延緩衰老［11］。腸桿菌、腸球菌、雙歧桿菌及乳酸桿菌這些優(yōu)勢菌群數(shù)量的變化可以作為腸道菌群失調(diào)及失調(diào)程度的判斷標(biāo)準(zhǔn)。本研究選擇臨床常用抗生素— —頭孢拉定建立腸道菌群失調(diào)模型［6］，使用不同濃度枸杞子提取物對腸道菌群失調(diào)小鼠進(jìn)行干預(yù)，通過測定小鼠糞便中上述4 種細(xì)菌數(shù)量的變化，研究枸杞子對腸道菌群失衡的調(diào)整作用。實驗結(jié)果表明，枸杞子提取物對腸道菌群失調(diào)小鼠腸道中乳酸桿菌和雙歧桿菌等益生菌的生長具有明顯的恢復(fù)作用，且作用效果要明顯優(yōu)于自然恢復(fù)組，具有顯著的益生元特性。

綜上，枸杞子提取物能夠促進(jìn)乳酸桿菌和雙歧桿菌等腸道益生菌的生長，為微生態(tài)制劑的開發(fā)及中藥合理使用提供了理論依據(jù)。這種中藥微生態(tài)制劑可以與抗生素合用，減弱藥物對益生菌的抑制和殺死作用，維持腸道菌群平衡。中藥以其獨特性能如天然性、整體調(diào)節(jié)、扶正祛邪、雙向調(diào)節(jié)等作用，將有可能在一定程度上解決抗生素帶來的副作用，并在治病防病、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫機(jī)能、平衡腸道微生態(tài)平衡等方面發(fā)揮一定的作用。

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