彭練慈，殷中瓊，康 帥，曲 徑，劉明輝，陳 萍

四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，雅安 625014

無乳鏈球菌又稱B 群鏈球菌，可引起奶牛乳房炎。目前對(duì)于奶牛乳房炎的治療主要依賴于抗生素，但抗生素容易造成乳汁殘留，而且耐藥菌株也不斷出現(xiàn)［1，2］。中草藥具有抗菌、消炎、低毒和細(xì)菌不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)，從傳統(tǒng)中草藥中篩選出有效的抗無乳鏈球菌藥物符合食品安全和公共衛(wèi)生需要。本實(shí)驗(yàn)室前期試驗(yàn)結(jié)果表明，黃連(Coptidis Rhizoma)、黃芩(Radix Scutellariae)和虎杖(PoLygonum cuspidatum)三味中藥的提取物對(duì)無乳鏈球菌有很好的抑菌效果，其抑菌效果明顯優(yōu)于某些抗菌的中藥材。為了提高三味中藥對(duì)無乳鏈球菌的抑菌活性，本研究對(duì)其有效物質(zhì)的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以便提高各味中藥有效物質(zhì)的產(chǎn)量達(dá)到更好的抑菌效果。

黃連為毛茛科植物黃連、三角葉黃連或云連的干燥根莖，具有清熱燥濕，瀉火解毒等功效［3］。其中主要有效成分是以小檗堿為代表的季銨型生物堿［4］，具有抗病毒、抗炎、抗菌、降血糖及免疫調(diào)節(jié)等作用［5］。因此黃連小檗堿的提取工藝研究對(duì)抗菌抗病毒及臨床研究有著重大的意義。

黃芩是唇形科植物黃芩的干燥根，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎等功效。主要成分是黃酮類化合物，其中黃芩苷、漢黃芩苷［6］、黃芩素等具有抑菌、利尿、抗炎、抗變態(tài)作用以及較強(qiáng)的抗癌反應(yīng)等生理效應(yīng)［7］。黃芩苷是從黃芩根中分離的一種黃酮類化合物，具有顯著的生物活性，如抗氧化、抗菌、抗病毒、抗過敏、調(diào)節(jié)免疫、降血糖等藥理活性［8］。

虎杖為蓼科植物虎杖的干燥根莖及根，具有祛風(fēng)利濕、散瘀定痛、止咳化痰等功效。虎杖中主要含有蒽醌類和芪類化合物，其中芪類成分白藜蘆醇具有抗菌、抗炎、抗癌、抗過敏、降血脂和抗氧化等多方面的藥理活性［9］。

目前，在對(duì)黃連、黃芩和虎杖三味藥的提取工藝研究中，以測定黃連的鹽酸小檗堿的含量［10］、黃芩的黃芩苷含量［11］、虎杖的白藜蘆醇含量［12］為指標(biāo)的研究較多，以浸膏得率為指標(biāo)的提取工藝研究較少，綜合文獻(xiàn)資料，本研究以提取溶劑濃度、料液比、提取次數(shù)、提取時(shí)間、提取溫度為影響因素，采用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，以浸膏得率及對(duì)無乳鏈球菌的最低抑菌濃度(MIC)值和最低殺菌濃度(MBC)為指標(biāo)，對(duì)三味中藥提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)選研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 中藥材

黃連(產(chǎn)地四川，批次:080406)、黃芩(產(chǎn)地陜西，批次:040824)、虎杖(產(chǎn)地四川，批次:081102)3味中藥均購于四川雅安惠民堂藥業(yè)連鎖有限責(zé)任公司，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)藥學(xué)系副教授范巧佳鑒定為正品。

1.1.2 菌株及培養(yǎng)基

無乳鏈球菌編號(hào)為CVCC1886，購自中國獸藥監(jiān)察所。

加有5% 小牛血清的胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)，加有5% 小牛血清的胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)培養(yǎng)基按照常規(guī)方法制作，用于無乳鏈球菌的培養(yǎng)。

1.1.3 儀器設(shè)備和試劑

電熱恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、索氏提取器、微量加樣器、二甲亞砜、無水乙醇、T 型涂布棒、90mm 玻璃培養(yǎng)皿。

1.2 方法

1.2.1 虎杖、黃芩有效成分提取工藝的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

以料液比(A)、乙醇濃度(B)、提取時(shí)間(C)及提取溫度(D)為考察對(duì)象，并根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)［13，14］，擬定各因素的三水平(見表1)，以提取有效物質(zhì)的浸膏得率，MIC 值和MBC 值為綜合考察指標(biāo)，選用L9(34)正交試驗(yàn)表進(jìn)行試驗(yàn)(見表2)，從而篩選出最佳的提取工藝。

按規(guī)定量稱取藥物9 份，每份約30 g，分別粉碎并編號(hào)1、2、3、4、5、6、7、8、9，精確稱量9 份藥物粉末，將精確稱量后的各藥物粉末于溶媒中加熱回流提取，為充分提取，每組都提取3 次，合并濾液并濃縮濾液至糊狀，放入55 ℃烘箱中3 d，直至烘干到恒重浸膏狀態(tài)，稱重并計(jì)算得率，封存?zhèn)溆茫謩e重復(fù)9 次。

表1 虎杖、黃芩因素水平表Table 1 Factors and levels of the extraction conditions in extracting P.cuspidatum and Radix Scutellariae

1.2.2 黃連有效成分提取工藝的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

以料液比(A)、乙醇濃度(B)、提取時(shí)間(C)及提取次數(shù)(D)為考察對(duì)象，并根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)［15］，擬定各因素的三水平(見表2)，以提取有效物質(zhì)的浸膏得率，MIC 值和MBC 值為綜合考察指標(biāo)，選用L9(34)正交試驗(yàn)表進(jìn)行試驗(yàn)(見表2)，從而篩選出最佳的提取工藝。

按規(guī)定量稱取藥物9 份，每份約30 g，分別粉碎并編號(hào)1、2、3、4、5、6、7、8、9，精確稱量9 份藥物粉末，將精確稱量后的各藥物粉末于溶媒中加熱回流提取，合并濾液并濃縮濾液至糊狀，放入55 ℃烘箱中3 d，直至烘干到恒重浸膏狀態(tài)，稱重并計(jì)算得率，封存?zhèn)溆?，分別重復(fù)9 次。

表2 黃連因素水平表Table 2 Factors and levels of the extraction conditions in extracting Coptidis Rhizoma

1.2.3 正交試驗(yàn)中藥有效成分的體外抑菌活性實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 細(xì)菌菌懸液的制備

挑取新鮮培養(yǎng)無乳鏈球菌的單個(gè)典型菌落接種于3 mL 的TSB 肉湯培養(yǎng)基中，置于37 ℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)18～24 h 后取出。吸取菌液0.5mL，用生理鹽水作10-1梯度稀釋，取10-7、10-8、10-9三個(gè)梯度的菌液0.1 mL 分別在6 個(gè)TSA 培養(yǎng)基上均勻攤開，放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h。計(jì)算出原液的細(xì)菌個(gè)數(shù)為1.60×1011CFU/mL。

臨用前將菌液用液體培養(yǎng)基稀釋成菌液濃度為1.60×107CFU/mL。

1.2.3.2 藥液的制備

精確稱取各正交試驗(yàn)的中藥有效部位提取物浸膏溶于蒸餾水中，配制成生藥濃度為1 g/mL 的溶液，100 ℃流通蒸汽滅菌30 min，置于4 ℃冰箱備用。

1.2.3.3 藥敏實(shí)驗(yàn)

采用試管2 倍稀釋法，取20 支滅菌試管，分為第一組和第二組，每組9 支。20 管分別加TSB 肉湯1 mL。在兩組的第1 管分別加1 mL 藥液，混勻后吸取1 mL 至第2 管中，依次類推，直至第9 管，第9 管吸取1 mL 棄去。向第一組的9 支試管加0.1 mL 的稀釋菌液，另一組9 支試管不加細(xì)菌，加0.1 mL 生理鹽水作為陰性對(duì)照組。第19 管不加藥液加0.1 mL 細(xì)菌作為陽性對(duì)照，第20 管不加藥液和細(xì)菌作為空白對(duì)照。則兩組的第1 管至第9 管的藥液濃度依次為500.00、250.00、125.00、62.50、31.25、15.60 mg/mL、7.80、3.90、1.95 mg/mL。置于37 ℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)18～24 h。以無菌生長的最低稀釋度為最小抑菌濃度(MIC)。

觀察藥物MIC 以上未見細(xì)菌生長的各管培養(yǎng)物，分別各取0.1 mL 移至不含藥的TSA 瓊脂平皿上，輕輕推開藥液，置37 ℃培養(yǎng)過夜，觀察有無細(xì)菌生長。按一般規(guī)定，平皿培養(yǎng)基中，計(jì)數(shù)少于5 個(gè)菌落者作為該藥的最低殺菌濃度(MBC)。

1.2.4 最佳提取工藝下各味中藥提取物的體外抑菌活性試驗(yàn)

按照“1.2.3”中的試驗(yàn)方法，將篩選出的各味中藥在最佳提取工藝下的有效物質(zhì)進(jìn)行體外抑菌活性的驗(yàn)證。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 虎杖最佳提取工藝的優(yōu)選

按照正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的提取方法對(duì)虎杖進(jìn)行有效物質(zhì)的提取，得到9 份虎杖有效提取物。通過對(duì)虎杖提取物各浸膏得率的計(jì)算及提取物對(duì)無乳鏈球菌MIC 值和MBC 值的測試，結(jié)果見表3 和表4。

表3 以浸膏得率和MIC 值與MBC 值之和為指標(biāo)的試驗(yàn)L9(34)直觀分析Table 3 The results of L9(34)tests by taking extraction yield and the sum of MIC and MBC as indexes

表4 以浸膏得率和MIC 值與MBC 值之和為指標(biāo)的試驗(yàn)L9(34)的方差分析Table 4 The variance analysis results of L9(34)tests by taking extraction yield and the sum of MIC and MBC as indexes

4 個(gè)因素對(duì)虎杖提取物浸膏得率的影響大小順序?yàn)镈＞C＞A＞B，最優(yōu)水平組合為A2B2C3D2，即料液比為1∶6，乙醇濃度為70%，提取溫度95 ℃，一次2 h，提取3 次。對(duì)MIC、MBC 之和的影響順序?yàn)镃＞A=D＞B，使MIC、MBC 之和最小的最優(yōu)水平為A1B1C2，3D1，即料液比為1∶5，乙醇濃度為60%，提取溫度85 ℃，一次提取1.5 或2 h，共提取3 次。

溫度對(duì)提取物浸膏得率的影響顯著，提取時(shí)間對(duì)MIC、MBC 之和的影響顯著。以浸膏得率，MIC、MBC 之和為指標(biāo)時(shí)所得工藝的差異因素都是乙醇濃度，且料液比、乙醇濃度對(duì)其影響都不大，為節(jié)約成本，將料液比設(shè)定為1∶5，乙醇濃度為60%。溫度對(duì)浸膏得率的影響顯著，對(duì)MIC、MBC 之和的影響不大，所以設(shè)定溫度為95 ℃。為提取充分，將時(shí)間設(shè)定為2 h。所以篩選虎杖的最優(yōu)水平為A1B1C3D3，即料液比為1∶5，乙醇濃度為60%，提取溫度為95 ℃，一次2 h，共提取3 次。

2.2 黃芩最佳提取工藝的優(yōu)選

按照正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的提取方法對(duì)黃芩進(jìn)行有效物質(zhì)的提取，得到9 份黃芩有效提取物。通過對(duì)黃芩提取物各浸膏得率的計(jì)算及提取物對(duì)無乳鏈球菌MIC 值和MBC 值的研究，結(jié)果見表5 和表6。

表5 以浸膏得率和MIC 值與MBC 值之和為指標(biāo)的試驗(yàn)L9(34)直觀分析Table 5 The results of L9(34)tests by taking extraction yield and the sum of MIC and MBC as indexes

表6 以浸膏得率和MIC 值與MBC 值之和為指標(biāo)的試驗(yàn)L9(34)的方差分析Table 6 Analysis of variance of L9(34)tests by taking extraction yield and the sum of MIC and MBC as indexes

4 個(gè)因素對(duì)黃芩提取物浸膏得率的影響大小順序?yàn)锳＞D＞B＞C，最優(yōu)水平組合為A3B1C3D3，即料液比為1∶10，乙醇濃度為55%，提取溫度為95℃，一次提取2 h，共提取3 次。對(duì)MIC、MBC 之和的影響順序?yàn)镃＞B＞D＞A，使MIC、MBC 之和最小最優(yōu)水平組合為A3B1C3D3，即料液比為1∶10，乙醇濃度為55%，提取溫度為95 ℃，一次提取2 h，共提取3 次。

4 個(gè)因素對(duì)黃芩提取物浸膏得率及MIC、MBC之和的影響均不顯著，所以篩選黃芩的最優(yōu)組合為A3B1C3D3，即料液比為1∶10，乙醇濃度為55%，提取溫度為95 ℃，一次提取2 h，共提取3 次。

2.3 黃連最佳提取工藝的優(yōu)選

按照正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的提取方法對(duì)黃連進(jìn)行有效物質(zhì)的提取，得到9 份黃連有效提取物。通過對(duì)黃連提取物各浸膏得率的計(jì)算及提取物對(duì)無乳鏈球菌MIC 值和MBC 值的研究，結(jié)果見表7 和表8。

表7 以浸膏得率和MIC 值與MBC 值之和為指標(biāo)的試驗(yàn)L9(34)直觀分析Table 7 The results of L9(34)tests by taking extract yield and the sum of MIC and MBC as indexes

表8 以浸膏得率和MIC 值與MBC 值之和為指標(biāo)的試驗(yàn)L9(34)的方差分析Table 8 Analysis of variance of L9(34)tests by taking extract yield and the sum of MIC and MBC as indexes

4 個(gè)因素對(duì)黃連提取物浸膏得率和MIC、MBC之和的影響大小順序?yàn)镈＞C＞B＞A，以得率為指標(biāo)的最優(yōu)水平組合為A1B3C2D2，即料液比1∶8，乙醇濃度80%，1.5 h 一次，提取2 次。以MIC、MBC 之和最小為指標(biāo)的最優(yōu)水平組合為A2B3C2D2，即料液比為1∶10，乙醇濃度80%，1.5 h 一次，提取2 次。

4 個(gè)因素對(duì)黃芩提取物浸膏得率及MIC、MBC之和的影響均不顯著，以浸膏得率，MIC、MBC 之和為指標(biāo)時(shí)所得工藝的差異因素都是料液比，料液比對(duì)浸膏影響很小，為節(jié)約成本，將料液比設(shè)定為1∶8。所以選擇黃連的最優(yōu)水平為A1B3C2D2，即料液比為1∶8，乙醇濃度80%，1.5 h 一次，提取2 次。

2.4 在最佳提取工藝下各味中藥提取物的體外抑菌活性

3 味中藥在本研究篩選出的最佳提取工藝下得到的浸膏物質(zhì)對(duì)無乳鏈球菌的MIC、MBC 值3 次結(jié)果的平均值見表9。

3 討論

黃連、黃芩、虎杖具有良好的抗無乳鏈球菌作用。文獻(xiàn)中對(duì)中藥材提取方法的選擇不盡相同，通常只會(huì)選擇一種提取方式。中藥化學(xué)成分非常復(fù)雜，抗菌成分也多種多樣，不同的提取方式會(huì)提取出不同的成分，同時(shí)抑菌效果也會(huì)不盡相同。在影響中藥提取質(zhì)量的系列因素中，溶媒量、提取時(shí)間、提取次數(shù)為主要因素。所以本研究采用正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，綜合考慮溶劑濃度、料液比、提取次數(shù)、提取時(shí)間、提取溫度5 種因素對(duì)3 種中藥有效物質(zhì)提取質(zhì)量的影響效果。在正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中，黃芩和虎杖均提取3 次，使其中藥里的成分得到了充分的提取。

表9 最佳提取工藝下的3 中藥對(duì)無乳鏈球菌的MIC 值和MBC 值(單位:mg/mL)Table 9 The MIC and MBC against S.agalactiae under the optimal extraction conditions of 3 traditional Chinese medicines(unit:mg/mL)

黃連、黃芩和虎杖有效物質(zhì)最佳提取工藝較嚴(yán)格的選擇標(biāo)準(zhǔn)為高效液相色譜法分別定量測定其中單一有效物質(zhì)含量［10-12］。但本研究不是為了提取分離所得到的有效物質(zhì)，只為從少量的原料藥材中得到更多的抑菌效果好的有效物質(zhì)，因而便以濃縮蒸干之后的浸膏得率及其最低抑菌濃度值(MIC)和最低殺菌濃度值(MBC)為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，從中篩選出抑菌活性優(yōu)異的提取方法及條件。MIC 值和MBC 值是評(píng)價(jià)藥物對(duì)細(xì)菌抑菌效果的有效指標(biāo)，MIC、MBC 值之和越小，其抑菌效果越好。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，按照一般的提取方法，黃連、黃芩和虎杖對(duì)無乳鏈球菌的MIC 分別為31.25、7.8 0、15.60 mg/mL［16］。在本研究中，黃連的MIC 和MBC值均為26.04 mg/mL，黃芩的MIC 和MBC 值為5.20、6.50 mg/mL。虎杖正交試驗(yàn)的藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，MIC 值的范圍為15.60～31.25 mg/mL，MBC 值的范圍是15.60～62.50 mg/mL，驗(yàn)證試驗(yàn)中虎杖的MIC 值為15.60 mg/mL，MBC 值在15.60～62.50 mg/mL 范圍內(nèi)。說明黃連、黃芩、虎杖在最佳提取工藝下的有效物質(zhì)抑菌效果明顯強(qiáng)于一般提取工藝的有效物質(zhì)。因此，篩選出的抗無乳鏈球菌的最佳提取工藝的提取方法可行，且簡便易行的評(píng)價(jià)方法也為以后的中藥提取研究擴(kuò)寬了方向，值得推廣使用。

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