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        貴州地區(qū)丙型肝炎患者病毒基因型與外周血輔助性T細(xì)胞因子表達(dá)相關(guān)性研究

        2015-01-07 07:24:10梁躍東楊興林洪章萍熊金鳳黃海
        貴州醫(yī)藥 2015年4期
        關(guān)鍵詞:丙型肝炎基因型細(xì)胞因子

        梁躍東 楊興林 洪章萍 熊金鳳 黃海

        (1.貴陽市第五人民醫(yī)院,貴州 貴陽550004;2.貴陽醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)系,貴州 貴陽550004)

        丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染后約80%發(fā)展為慢性肝炎,約25%發(fā)展為肝硬化、肝癌[1]。引起丙肝慢性化的重要原因之一是宿主免疫功能的變化,其中T淋巴細(xì)胞及其所分泌的細(xì)胞因子的變化顯著影響了感染的進(jìn)程。因此了解近年來貴州地區(qū) HCV流行株的基因型,了解HCV感染過程中T淋巴細(xì)胞及其細(xì)胞因子的變化,對臨床治療具有指導(dǎo)意義。

        1 資料與方法

        1.1 研究對象 選擇貴陽市第五人民醫(yī)院2011年10月至2013年7月傳染科門診和住院患者中HCV RNA為陽性的慢性丙肝患者198例,其中男109例,女89例,年齡20~74歲;診斷均符合2004年中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會、中華醫(yī)學(xué)會傳染病與寄生蟲病學(xué)分會《丙型肝炎防治方案》,所有患者的抗-HCV檢測為陽性,且排除其他類型肝炎病毒感染,均未使用過干擾素和其他免疫調(diào)節(jié)劑。45例健康對照標(biāo)本來自本院健康體檢人群。

        1.2 HCV-RNA定量檢測 采用實(shí)時(shí)熒光定量(RQ-PCR)法,采用上??迫A股份有限公司生產(chǎn)的HCV熒光定量PCR試劑盒檢測,靈敏度為5×102IU/mL。

        1.3 HCV基因分型 用異硫氰酸胍(Trizol)-氯仿-異丙醇抽提血清中的HCV RNA,用75%的乙醇洗滌RNA沉淀,15μL DEPC水溶解核酸-70℃保存或立即冰浴備用。依據(jù)HCV Core-E1區(qū)核苷酸序列合成4條引物,引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。引物序列為:CEI-ESP 5’-GCAACAGGGAACCTTCCTGGTTGCTC-3’,CEI-EAP 5’-CGTAGGGGACCAGTTCATCATCAT-3’,CEI-ISP 5’-AACCTTCCTGGTTGCTCTTTCTCTAT-3’,CEI-IAP 5’-GT-TCATCATCATATCCCATGCCAT-3’。逆轉(zhuǎn)錄及首輪PCR同時(shí)進(jìn)行,逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為:42℃40min;94℃15s,60℃15s,72℃30s,共擴(kuò)增30個(gè)循環(huán);72℃延伸5min,得到外擴(kuò)增PCR產(chǎn)物。取2μL為模板,進(jìn)行第2輪PCR反應(yīng),PCR循環(huán)參數(shù)與首輪相同,得到內(nèi)擴(kuò)增PCR產(chǎn)物,擴(kuò)增片段為474bp。PCR產(chǎn)物置1.5%的瓊脂糖電泳20min,凝膠成像分析儀觀察結(jié)果。取陽性PCR產(chǎn)物,用Promega的PCR DNA純化體系進(jìn)行純化,送北京諾賽基因組研究中心有限公司測序,CEl-ISP作為測序引物。

        1.4 細(xì) 胞 因 子 檢 測 血 清IL-2、IL-8、IL-10 和TFN-α檢測采用ELISA法,試劑盒購自生物晶美工程有限公司,按試劑盒說明方法進(jìn)行檢測。

        1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,年齡、血清細(xì)胞因子水平數(shù)據(jù)用t檢驗(yàn),以(ˉx±s)表示,性別資料用χ2檢驗(yàn),不同基因型細(xì)胞因子水平比較用F檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié) 果

        2.1 198份丙型肝炎患者HCV基因分型 結(jié)果顯示,1a型4例(2.02%),1b 型71例(35.86%),2a型9例(4.55%),3a型29例(14.65%),3b型47例(23.74%),6a 型 37 例 (18.69%),6d 型 1 例(0.50%)。

        2.2 慢性丙型肝炎患者血清細(xì)胞因子水平與正常對照組的比較 198例慢性丙型肝炎患者血清細(xì)胞因子水平與正常對照組比較結(jié)果見表1,血清IL-8與正常對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而慢性丙型肝炎患者血清IL-2、IL-10、TNF-α與正常對照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        表1 慢性丙型肝炎患者血清細(xì)胞因子水平與正常對照組比較 (pg/mL)

        2.3 慢性丙型肝炎患者不同基因型細(xì)胞因子水平比較 184例不同基因型之間細(xì)胞因子水平的結(jié)果比較,發(fā)現(xiàn)IL-2與TNF-α在各基因型間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IL-8在lb型患者血清中含量與3a、3b、6a型患者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),3a、3b、6a型患者血清中IL-8含量兩兩比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);IL-10在lb型患者血清中含量與3a、3b、6a型患者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),3a、3b、6a型患者血清中IL-10含量兩兩比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。1a、2a、6a檢測例數(shù)較少未進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較。見表2。

        表2 丙型肝炎患者不同基因型細(xì)胞因子水平比較

        3 討 論

        慢性丙肝感染可導(dǎo)致肝硬化、原發(fā)性肝癌,但發(fā)病機(jī)制尚不明確。近來發(fā)現(xiàn),宿主免疫應(yīng)答在HCV感染的慢性化中,尤其是Th1/Th2相關(guān)因子表達(dá)失衡在丙型肝炎發(fā)病機(jī)制中可能起重要作用[2-3]。細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)是主要的效應(yīng)細(xì)胞,激活的CTL細(xì)胞通過釋放穿孔素和Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑清除病毒,同時(shí)導(dǎo)致肝細(xì)胞炎癥壞死。CTL細(xì)胞需在Th細(xì)胞輔佐下才能充分發(fā)揮作用。Th細(xì)胞即輔助性T淋巴細(xì)胞,前體Th0細(xì)胞可分化為Th1/Th2兩個(gè)優(yōu)勢亞型,Thl細(xì)胞主要分泌IL-2、IL-12、IFN 、TNF等,能促進(jìn)細(xì)胞免疫,對 CTL的功能有輔佐作用;Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等,對 Th1細(xì)胞有抑制作用,它抑制細(xì)胞免疫,增強(qiáng)體液免疫,細(xì)胞因子水平和Thl/Th2優(yōu)勢亞群兩者互相影響,互為因果。Thl細(xì)胞有利于病毒的清除而Th2細(xì)胞主要與組織損傷及慢性化有關(guān)。Thl細(xì)胞與Th2細(xì)胞之間的活性的平衡決定了感染的結(jié)局及臨床表現(xiàn),進(jìn)而影響HCV感染者的慢性化和臨床轉(zhuǎn)歸。

        本文結(jié)果顯示,慢性丙型肝炎與正常對照組比較,丙型肝炎患者體內(nèi)存在Th1型細(xì)胞因子分泌IL-2、TNF-α明顯降低,Th2型細(xì)胞因子分泌IL-10增高,可抑制宿主的細(xì)胞免疫功能,使機(jī)體不能清除病毒,可能是HCV感染慢性化的重要機(jī)制,與相關(guān)報(bào)道[4-5]相符。分析以上研究結(jié)果可知,CHC患者體內(nèi)Th2類細(xì)胞因子均呈高表達(dá)狀態(tài),Th1類細(xì)胞因子表達(dá)情況的報(bào)道尚不完全一致,可能與收集病例樣本有關(guān)。本研究也發(fā)現(xiàn)IL-2、TNF-α表達(dá)較低的現(xiàn)象,CHC患者Th1類細(xì)胞因子表達(dá)受到抑制,而Th2類細(xì)胞因子高表達(dá),可能Th1類細(xì)胞因子水平低下是導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞免疫功能缺陷、使病毒清除障礙及感染慢性化的原因之一。

        目前干擾素-a聯(lián)合利巴韋林(RBV)是公認(rèn)治療慢性丙型肝炎有效的藥物,能有效抑制患者HCV復(fù)制,減輕肝臟炎癥壞死和肝纖維化。在治療前評估、療效預(yù)測及個(gè)體化療程,其中基因型最為重要,目前多數(shù)指南推薦基本療程為:基因1型48周,基因2/3型24周[6]。近年來,相關(guān)的研究結(jié)果顯示,在治療過程中Thl/Th2類相關(guān)因子均有不同的變化,賈紅宇等[7]對24例HCV攜帶者和27例CHC患者血清IL-18和IL-10水平的研究發(fā)現(xiàn),CHC患者該兩種細(xì)胞因子水平明顯高于正常對照組和HCV攜帶組,27例CHC患者經(jīng)干擾素-a治療6個(gè)月后IL-18和IL-10水平較治療前明顯降低。血清中IL-10水平由高到低依次為:治療無應(yīng)答組>部分應(yīng)答組>完全應(yīng)答組。胡敏濤等[8]報(bào)道用聚乙二醇干擾素a-2b治療的慢性丙型肝炎患者58例,用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測治療前后患者血清INF-r、IL-2、IL-6、IL-10的變化,治療48周后應(yīng)答組與無應(yīng)答組比較,INF-r、IL-2水平均顯著升高,IL-6、IL-10水平則顯著降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。慢性丙型肝炎患者血清IL-8含量明顯增高,IL-8能降低2’-5寡腺苷合成酶活性,抑制內(nèi)源性IFN-a的合成,有研究證明,NS5A基因的刺激可使IL-8的合成增加8~12倍,發(fā)現(xiàn)非結(jié)構(gòu)蛋白NS3和NS4抗體水平與病毒血癥程度無相關(guān)性,高水平病毒血癥患者的抗-NS5抗體顯著增高,說明NS5蛋白是激活HCV復(fù)制的重要因子。以上研究結(jié)果表明,某些細(xì)胞因子,特別是IL-2、IL-10、IL-8、TNF等的水平,可做為CHC預(yù)后和預(yù)測IFN治療效果的指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)通過對CHC患者血清IL-2、IL-10、IL-8、TNF-a及基因型檢測,結(jié)果顯示在治療前CHC患者1b型中外周血IL-8、IL-10明顯高于3a、3b、6a型,提示1b型患者抗病毒治療效果不佳的因素之一。在基因型與細(xì)胞因子的關(guān)系報(bào)道較少,在不同基因型CHC患者抗病毒治療過程中細(xì)胞因子的動態(tài)變化正做進(jìn)一步研究。

        總之,丙型肝炎的顯著臨床特點(diǎn)就是極易慢性化,而T淋巴細(xì)胞以及細(xì)胞因子在HCV感染慢性化中起著重要作用,Thl/Th2相關(guān)細(xì)胞因子水平不但與丙型肝炎的慢性化和疾病進(jìn)程有關(guān),而且與IFN療效關(guān)系密切。HCV基因型對于肝損傷、疾病進(jìn)展和轉(zhuǎn)歸的影響尚有不同觀點(diǎn),不同基因型與HCV感染后的病情變化以及干擾素的療效有一定相關(guān)性。如何能把基因型與相關(guān)細(xì)胞因子水平的變化在預(yù)測丙型肝炎的診斷、治療和預(yù)防,規(guī)范檢測方法,仍需進(jìn)一步深入研究。

        [1] Hezode C,F(xiàn)orestier N,Dusheiko G,et al.Telaprevir and peginterferon with or with out ribavirin for chronic HCV infection[J].N Engl J Med,2009,360(18):1839-1850.

        [2] 董漪,張鴻飛,陳昊,等.小兒慢性丙型肝炎外周血T細(xì)胞亞群和TH1/TH2型細(xì)胞因子的研究[J].中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志,2007,21(1):26-28.

        [3] Par G,Berki T,Palinkas L,et al.Immunology of HCV infection:the causes of impaired Cellular immune response and the effect of antiviral treatment[J].Orv Hetil,2006,147(13):591-600.

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        [8] 胡敏濤,毛燕群,裴豪,等.聚乙二醇干擾素治療丙型肝炎前后淋巴細(xì)胞亞群及輔助性T淋巴細(xì)胞因子的變化[J].中國全科醫(yī)學(xué)雜志,2011,14(11):3829-3832.

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