危晴+楊國偉+蘇東海+陳亮
摘要:采用超聲波輔助萃取法提取,高效液相色譜法測(cè)定了鎖陽(Cynomorium songaricum)中的熊果酸含量。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,以乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲時(shí)間、超聲功率為研究對(duì)象,進(jìn)行了4因素3水平正交試驗(yàn)。結(jié)果表明,熊果酸在4.0~16.0 μg/μL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系,回歸方程為y=622.7x-85.517,r=0.999 8,加樣回收率為98.08%。鎖陽中熊果酸最佳提取工藝為:超聲功率150 W,料液比1∶25,85%(V/V,下同)乙醇超聲提取30 min,在此條件下,鎖陽中熊果酸含量為1.53%。該工藝能有效提取鎖陽中熊果酸,為評(píng)價(jià)中藥材中的熊果酸水平提供參考。
關(guān)鍵詞:鎖陽(Cynomorium songaricum);熊果酸;超聲提取;高效液相色譜
中圖分類號(hào):TS201.2 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A ? ? ? ?文章編號(hào):0439-8114(2014)12-2894-04
Ultrasonic Extraction and HPLC Determination of Ursolic Acid in Cynomorium songaricun
WEI Qing,YANG Guo-wei,SU Dong-hai,CHEN Liang
(Beijing Polytechnic,Beijing 100029,China)
Abstract:Ursolic acid in Cynomorium songaricum was ultrasonically extracted and detected by HPLC. According to single-factor experiments,three levels of four factors including ethanol concentration,material-liquid ratio,ultrasonic time, and ultrasonic power were selected for the orthogonal design.The results showed that the calibration curve of ursolic acid was linear (r=0.999 8) in the range of 4.0~16.0 μg/μL.The equation was y=622.7x-85.517,r=0.999 8,and recovery was 98.08%.The optimum extraction was carried out in 85%(V/V) ethanol for 30 min with the ultrasonic power of 150 W,and the material-liquid ratio 1∶25.Under the optimal conditions,the content of ursolic acid was 1.53%.The method can extract ursolic acid efficiently,and provide a reference for evaluation ursolic acid in medicinal materials.
Key words:Cynomorium songaricum;ursolic acid;ultrasonic extraction; HPLC
鎖陽(Cynomorium songaricum)是一種稀有名貴中草藥,俗稱“不老藥”,是鎖陽科鎖陽屬的單科單屬單種植物[1,2],含有多種藥用成分,例如:有機(jī)酸、黃酮類、氨基酸等[3-6],具有抗腫瘤、降低血糖等作用[7]。鎖陽中的熊果酸(ursolic acid)又名烏索酸、烏蘇酸,是存在于天然植物中的一種三萜類化合物[8],具有保肝、抗腫瘤、降血脂等作用[9]。熊果酸主要通過酶法輔助法[10]、有機(jī)溶劑萃取法[11]、大孔樹脂吸附法[12]、超臨界萃取法[13]、超聲輔助[14]等方法提取;采用分光光度法[15,16]、高效液相色譜法[17]、近紅外光譜測(cè)定法[18]、薄層掃描[19]等方法測(cè)定。
本試驗(yàn)以鎖陽為原料,采用超聲輔助醇法提取鎖陽中熊果酸,以乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲時(shí)間、超聲功率為因素,通過單因素和正交試驗(yàn)確定最佳提取工藝,旨在為鎖陽中熊果酸的進(jìn)一步開發(fā)利用提供試驗(yàn)基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。
1 ?材料與方法
1.1 ?材料
鎖陽產(chǎn)自甘肅省張掖平西湖地區(qū)。
1.2 ?儀器與試劑
1100型高效液相色譜儀(Agilent,美國);AR2140型電子分析天平(上海奧豪斯國際貿(mào)易有限公司);4000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(海道爾夫,德國);SHB-II循環(huán)式真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司);恒溫水浴鍋HH-S(江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠);粉碎機(jī)(瑞安市百信藥機(jī)器械廠);電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海蘇達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司);標(biāo)準(zhǔn)篩(新鄉(xiāng)市三圓堂機(jī)械有限公司);KQ250DE數(shù)控超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所);甲醇為色譜純,無水乙醇為分析純,去離子水。
1.3 ?方法
1.3.1 ?色譜條件 ?Atlantis C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,5 μm),流動(dòng)相為水-甲醇(10∶90,V/V),流速為0.8 mL/min,檢測(cè)波長205 nm,柱溫25 ℃,進(jìn)樣量10 μL。
1.3.2 ?熊果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 ?稱取105 ℃干燥至恒重的熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品20.0 mg,用甲醇溶解并定容至25 mL,配制0.80 μg/μL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取不同體積的標(biāo)準(zhǔn)溶液5~20 μL,甲醇定容至10 mL,進(jìn)樣并測(cè)定峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo),計(jì)算線性回歸方程。endprint
1.3.3 ?熊果酸的提取與分析 ?稱取5 g鎖陽粉末樣品(粉碎機(jī)粉碎,過40目篩),按照1∶40(m/V,下同)加入氯仿回流3 h脫脂,回收溶劑,殘?jiān)鼡]干。用85%乙醇(V/V,下同)按20∶1液固比浸泡殘?jiān)?4 h后,超聲波提取45 min,離心得提取液,濾渣重復(fù)提取1次,合并提取液減壓濃縮,取出殘留液,甲醇定容至25 mL。取樣品過0.45 μm微孔濾膜后,在上述色譜條件下測(cè)定熊果酸的含量
1.3.4 ?鎖陽中熊果酸提取的單因素試驗(yàn) ?①乙醇體積分?jǐn)?shù)。稱取1 g脫脂鎖陽樣品,按照料液比1∶20準(zhǔn)確加入70%~95%乙醇溶液,超聲功率150 W,超聲45 min后,參照“1.3.1”和“1.3.3”分析;②料液比。稱取1 g脫脂鎖陽樣品,按不同料液比(1∶5~1∶30)加入85%乙醇溶液,超聲功率150 W,超聲時(shí)間45 min,后續(xù)步驟同①;③超聲時(shí)間。稱取1 g脫脂鎖陽樣品,料液比1∶20,乙醇濃度85%,超聲功率150 W,選取超聲波輔助提取的時(shí)間為10~60 min,離心取上清液,后續(xù)步驟同①;④超聲功率。稱取1 g脫脂鎖陽樣品,乙醇體積分?jǐn)?shù)為85%,料液比1∶20,超聲時(shí)間40 min,超聲波功率選擇50~300 W,后續(xù)步驟同①。
1.3.5 ?正交試驗(yàn) ?在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,綜合考慮多因素相互作用對(duì)鎖陽熊果酸提取的影響,根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,采用L9(34)正交設(shè)計(jì)。
2 ?結(jié)果與討論
2.1 ?色譜分析結(jié)果
標(biāo)準(zhǔn)品和樣品提取液中熊果酸色譜圖分別見圖1和圖2。在該條件下,熊果酸可有效分離。
2.2 ?單因素試驗(yàn)
單因素試驗(yàn)結(jié)果見圖3~圖6。
由圖3可知,乙醇體積分?jǐn)?shù)為85%時(shí),熊果酸含量最大;隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增大,含量呈下降趨勢(shì)。主要原因是乙醇體積分?jǐn)?shù)增大會(huì)導(dǎo)致過多的醇溶物質(zhì)與熊果酸競爭,導(dǎo)致提取的熊果酸含量下降。
由圖4可知,隨著料液比增大,熊果酸含量逐漸增大,當(dāng)料液比為1∶20時(shí),熊果酸含量最大;隨著料液比增大,熊果酸含量呈下降趨勢(shì)。主要原因是隨著料液比增大,鎖陽中其他成分溶解的幾率增大,同時(shí)延長了后續(xù)的濃縮過程,造成熊果酸的損失。
由圖5可知,當(dāng)超聲40 min時(shí),熊果酸含量最大。隨著超聲時(shí)間的延長,過多的醇溶物質(zhì)與熊果酸競爭,影響了熊果酸的提取率,造成含量下降。
由圖6可知,超聲功率為150 W時(shí),熊果酸含量達(dá)到最大;但過強(qiáng)的超聲波機(jī)械剪切力,破壞了熊果酸的結(jié)構(gòu),導(dǎo)致熊果酸含量下降。
2.3 ?正交試驗(yàn)
在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,設(shè)計(jì)乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲時(shí)間、超聲功率的4因素3水平正交試驗(yàn),因素水平見表1,正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。
由表2極差分析可知,影響熊果酸提取效率的主次因素分別為料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲功率、超聲時(shí)間。最佳提取工藝為A2B3C1D2,即乙醇體積分?jǐn)?shù)為85%、料液比1∶25、超聲時(shí)間30 min、超聲功率150 W,在此組合下,獲得樣品中的熊果酸可達(dá)1.53%。
2.4 方法評(píng)價(jià)
吸取標(biāo)準(zhǔn)品10 μL,重復(fù)進(jìn)樣6次,求得峰面積RSD為1.39%,表明儀器精密度良好。
吸取標(biāo)準(zhǔn)品10 μL,進(jìn)樣,分別于0~6 h,每間隔0.5 h重復(fù)上述操作,求得峰面積RSD為1.9%,結(jié)果表明標(biāo)準(zhǔn)品溶液在6 h內(nèi)基本穩(wěn)定。
吸取已知濃度的供試品溶液500 μL,加入0.80 mg/mL的熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液500 μL,混勻,進(jìn)樣10 μL,平行測(cè)定3次,求得熊果酸平均回收率為98.08%。
稱取已知濃度的同一樣品6份,依次分別制得樣品溶液,精密吸取樣品溶液10 μL,進(jìn)樣,求得峰面積RSD為1.9%。
3 ?結(jié)論
鎖陽中熊果酸在4.0~16.0 μg/μL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.999 8),其回歸方程為y=622.7x-85.517,r=0.999 8。精密度RSD為1.39%,加樣回收率平均為98.08%,RSD為1.9%。熊果酸提取的最佳工藝條件是:乙醇體積分?jǐn)?shù)為85%、料液比1∶25、超聲時(shí)間30 min、超聲功率150 W,鎖陽中熊果酸的含量約為1.53%。該方法提取鎖陽中的熊果酸含量較高,可為開發(fā)利用相關(guān)藥材提供參考。
參考文獻(xiàn):
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[16] 莫崢嶸,王安偉,莫燕琴,等.青梅莖中總?cè)扑岬暮繙y(cè)定[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥,2008,19(11):2580-2581.
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[18] 宋麗麗,范丙義,徐曉杰,等.近紅外光譜法用于六味地黃丸模擬樣品中熊果酸的含量測(cè)定[J].中國中藥雜志,2006,31(19):1590-1593.
[19] 邱 ?震,周家才.薄層掃描法測(cè)定左歸丸中熊果酸含量[J].安徽醫(yī)藥,2008,12(8):698-699.endprint
1.3.3 ?熊果酸的提取與分析 ?稱取5 g鎖陽粉末樣品(粉碎機(jī)粉碎,過40目篩),按照1∶40(m/V,下同)加入氯仿回流3 h脫脂,回收溶劑,殘?jiān)鼡]干。用85%乙醇(V/V,下同)按20∶1液固比浸泡殘?jiān)?4 h后,超聲波提取45 min,離心得提取液,濾渣重復(fù)提取1次,合并提取液減壓濃縮,取出殘留液,甲醇定容至25 mL。取樣品過0.45 μm微孔濾膜后,在上述色譜條件下測(cè)定熊果酸的含量
1.3.4 ?鎖陽中熊果酸提取的單因素試驗(yàn) ?①乙醇體積分?jǐn)?shù)。稱取1 g脫脂鎖陽樣品,按照料液比1∶20準(zhǔn)確加入70%~95%乙醇溶液,超聲功率150 W,超聲45 min后,參照“1.3.1”和“1.3.3”分析;②料液比。稱取1 g脫脂鎖陽樣品,按不同料液比(1∶5~1∶30)加入85%乙醇溶液,超聲功率150 W,超聲時(shí)間45 min,后續(xù)步驟同①;③超聲時(shí)間。稱取1 g脫脂鎖陽樣品,料液比1∶20,乙醇濃度85%,超聲功率150 W,選取超聲波輔助提取的時(shí)間為10~60 min,離心取上清液,后續(xù)步驟同①;④超聲功率。稱取1 g脫脂鎖陽樣品,乙醇體積分?jǐn)?shù)為85%,料液比1∶20,超聲時(shí)間40 min,超聲波功率選擇50~300 W,后續(xù)步驟同①。
1.3.5 ?正交試驗(yàn) ?在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,綜合考慮多因素相互作用對(duì)鎖陽熊果酸提取的影響,根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,采用L9(34)正交設(shè)計(jì)。
2 ?結(jié)果與討論
2.1 ?色譜分析結(jié)果
標(biāo)準(zhǔn)品和樣品提取液中熊果酸色譜圖分別見圖1和圖2。在該條件下,熊果酸可有效分離。
2.2 ?單因素試驗(yàn)
單因素試驗(yàn)結(jié)果見圖3~圖6。
由圖3可知,乙醇體積分?jǐn)?shù)為85%時(shí),熊果酸含量最大;隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增大,含量呈下降趨勢(shì)。主要原因是乙醇體積分?jǐn)?shù)增大會(huì)導(dǎo)致過多的醇溶物質(zhì)與熊果酸競爭,導(dǎo)致提取的熊果酸含量下降。
由圖4可知,隨著料液比增大,熊果酸含量逐漸增大,當(dāng)料液比為1∶20時(shí),熊果酸含量最大;隨著料液比增大,熊果酸含量呈下降趨勢(shì)。主要原因是隨著料液比增大,鎖陽中其他成分溶解的幾率增大,同時(shí)延長了后續(xù)的濃縮過程,造成熊果酸的損失。
由圖5可知,當(dāng)超聲40 min時(shí),熊果酸含量最大。隨著超聲時(shí)間的延長,過多的醇溶物質(zhì)與熊果酸競爭,影響了熊果酸的提取率,造成含量下降。
由圖6可知,超聲功率為150 W時(shí),熊果酸含量達(dá)到最大;但過強(qiáng)的超聲波機(jī)械剪切力,破壞了熊果酸的結(jié)構(gòu),導(dǎo)致熊果酸含量下降。
2.3 ?正交試驗(yàn)
在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,設(shè)計(jì)乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲時(shí)間、超聲功率的4因素3水平正交試驗(yàn),因素水平見表1,正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。
由表2極差分析可知,影響熊果酸提取效率的主次因素分別為料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲功率、超聲時(shí)間。最佳提取工藝為A2B3C1D2,即乙醇體積分?jǐn)?shù)為85%、料液比1∶25、超聲時(shí)間30 min、超聲功率150 W,在此組合下,獲得樣品中的熊果酸可達(dá)1.53%。
2.4 方法評(píng)價(jià)
吸取標(biāo)準(zhǔn)品10 μL,重復(fù)進(jìn)樣6次,求得峰面積RSD為1.39%,表明儀器精密度良好。
吸取標(biāo)準(zhǔn)品10 μL,進(jìn)樣,分別于0~6 h,每間隔0.5 h重復(fù)上述操作,求得峰面積RSD為1.9%,結(jié)果表明標(biāo)準(zhǔn)品溶液在6 h內(nèi)基本穩(wěn)定。
吸取已知濃度的供試品溶液500 μL,加入0.80 mg/mL的熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液500 μL,混勻,進(jìn)樣10 μL,平行測(cè)定3次,求得熊果酸平均回收率為98.08%。
稱取已知濃度的同一樣品6份,依次分別制得樣品溶液,精密吸取樣品溶液10 μL,進(jìn)樣,求得峰面積RSD為1.9%。
3 ?結(jié)論
鎖陽中熊果酸在4.0~16.0 μg/μL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.999 8),其回歸方程為y=622.7x-85.517,r=0.999 8。精密度RSD為1.39%,加樣回收率平均為98.08%,RSD為1.9%。熊果酸提取的最佳工藝條件是:乙醇體積分?jǐn)?shù)為85%、料液比1∶25、超聲時(shí)間30 min、超聲功率150 W,鎖陽中熊果酸的含量約為1.53%。該方法提取鎖陽中的熊果酸含量較高,可為開發(fā)利用相關(guān)藥材提供參考。
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[15] 李國章,于華忠,卜曉英,等.分光光度法測(cè)定湘產(chǎn)苦丁茶中熊果酸含量[J].光譜實(shí)驗(yàn)室,2006,23(2):401-404.
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1.3.3 ?熊果酸的提取與分析 ?稱取5 g鎖陽粉末樣品(粉碎機(jī)粉碎,過40目篩),按照1∶40(m/V,下同)加入氯仿回流3 h脫脂,回收溶劑,殘?jiān)鼡]干。用85%乙醇(V/V,下同)按20∶1液固比浸泡殘?jiān)?4 h后,超聲波提取45 min,離心得提取液,濾渣重復(fù)提取1次,合并提取液減壓濃縮,取出殘留液,甲醇定容至25 mL。取樣品過0.45 μm微孔濾膜后,在上述色譜條件下測(cè)定熊果酸的含量
1.3.4 ?鎖陽中熊果酸提取的單因素試驗(yàn) ?①乙醇體積分?jǐn)?shù)。稱取1 g脫脂鎖陽樣品,按照料液比1∶20準(zhǔn)確加入70%~95%乙醇溶液,超聲功率150 W,超聲45 min后,參照“1.3.1”和“1.3.3”分析;②料液比。稱取1 g脫脂鎖陽樣品,按不同料液比(1∶5~1∶30)加入85%乙醇溶液,超聲功率150 W,超聲時(shí)間45 min,后續(xù)步驟同①;③超聲時(shí)間。稱取1 g脫脂鎖陽樣品,料液比1∶20,乙醇濃度85%,超聲功率150 W,選取超聲波輔助提取的時(shí)間為10~60 min,離心取上清液,后續(xù)步驟同①;④超聲功率。稱取1 g脫脂鎖陽樣品,乙醇體積分?jǐn)?shù)為85%,料液比1∶20,超聲時(shí)間40 min,超聲波功率選擇50~300 W,后續(xù)步驟同①。
1.3.5 ?正交試驗(yàn) ?在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,綜合考慮多因素相互作用對(duì)鎖陽熊果酸提取的影響,根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,采用L9(34)正交設(shè)計(jì)。
2 ?結(jié)果與討論
2.1 ?色譜分析結(jié)果
標(biāo)準(zhǔn)品和樣品提取液中熊果酸色譜圖分別見圖1和圖2。在該條件下,熊果酸可有效分離。
2.2 ?單因素試驗(yàn)
單因素試驗(yàn)結(jié)果見圖3~圖6。
由圖3可知,乙醇體積分?jǐn)?shù)為85%時(shí),熊果酸含量最大;隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增大,含量呈下降趨勢(shì)。主要原因是乙醇體積分?jǐn)?shù)增大會(huì)導(dǎo)致過多的醇溶物質(zhì)與熊果酸競爭,導(dǎo)致提取的熊果酸含量下降。
由圖4可知,隨著料液比增大,熊果酸含量逐漸增大,當(dāng)料液比為1∶20時(shí),熊果酸含量最大;隨著料液比增大,熊果酸含量呈下降趨勢(shì)。主要原因是隨著料液比增大,鎖陽中其他成分溶解的幾率增大,同時(shí)延長了后續(xù)的濃縮過程,造成熊果酸的損失。
由圖5可知,當(dāng)超聲40 min時(shí),熊果酸含量最大。隨著超聲時(shí)間的延長,過多的醇溶物質(zhì)與熊果酸競爭,影響了熊果酸的提取率,造成含量下降。
由圖6可知,超聲功率為150 W時(shí),熊果酸含量達(dá)到最大;但過強(qiáng)的超聲波機(jī)械剪切力,破壞了熊果酸的結(jié)構(gòu),導(dǎo)致熊果酸含量下降。
2.3 ?正交試驗(yàn)
在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,設(shè)計(jì)乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲時(shí)間、超聲功率的4因素3水平正交試驗(yàn),因素水平見表1,正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。
由表2極差分析可知,影響熊果酸提取效率的主次因素分別為料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲功率、超聲時(shí)間。最佳提取工藝為A2B3C1D2,即乙醇體積分?jǐn)?shù)為85%、料液比1∶25、超聲時(shí)間30 min、超聲功率150 W,在此組合下,獲得樣品中的熊果酸可達(dá)1.53%。
2.4 方法評(píng)價(jià)
吸取標(biāo)準(zhǔn)品10 μL,重復(fù)進(jìn)樣6次,求得峰面積RSD為1.39%,表明儀器精密度良好。
吸取標(biāo)準(zhǔn)品10 μL,進(jìn)樣,分別于0~6 h,每間隔0.5 h重復(fù)上述操作,求得峰面積RSD為1.9%,結(jié)果表明標(biāo)準(zhǔn)品溶液在6 h內(nèi)基本穩(wěn)定。
吸取已知濃度的供試品溶液500 μL,加入0.80 mg/mL的熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液500 μL,混勻,進(jìn)樣10 μL,平行測(cè)定3次,求得熊果酸平均回收率為98.08%。
稱取已知濃度的同一樣品6份,依次分別制得樣品溶液,精密吸取樣品溶液10 μL,進(jìn)樣,求得峰面積RSD為1.9%。
3 ?結(jié)論
鎖陽中熊果酸在4.0~16.0 μg/μL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.999 8),其回歸方程為y=622.7x-85.517,r=0.999 8。精密度RSD為1.39%,加樣回收率平均為98.08%,RSD為1.9%。熊果酸提取的最佳工藝條件是:乙醇體積分?jǐn)?shù)為85%、料液比1∶25、超聲時(shí)間30 min、超聲功率150 W,鎖陽中熊果酸的含量約為1.53%。該方法提取鎖陽中的熊果酸含量較高,可為開發(fā)利用相關(guān)藥材提供參考。
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