孫傳波+郭嘉+袁英

摘要：以玉米（Zea mays L.）HiII的幼胚為外植體，β-葡萄糖苷酸酶基因（GUS）為報告基因，通過農(nóng)桿菌介導轉化法對影響遺傳轉化體系的外植體大小、農(nóng)桿菌濃度、熱預處理溫度、侵染時間、共培養(yǎng)及恢復培養(yǎng)時間、抗生素、篩選劑等因素進行優(yōu)化，以建立農(nóng)桿菌介導玉米幼胚遺傳轉化體系。結果表明，幼胚大小為1.0～1.5 mm，農(nóng)桿菌菌液的OD600 nm為0.5，40 ℃熱處理3 min，侵染8 min，共培養(yǎng)3 d和恢復培養(yǎng)4 d，100 mg/L羧芐青霉素作為抑菌劑，雙丙氨膦作為篩選劑時為最佳遺傳轉化條件。通過該優(yōu)化體系已獲得多種轉基因玉米材料，表明該體系具有較高的可重復性和可靠性。

關鍵詞：農(nóng)桿菌介導轉化法;玉米（Zea mays L.）;幼胚;遺傳轉化

中圖分類號：S513;Q789 ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ?文章編號：0439-8114（2014）12-2743-04

Establishing Genetic Transformation System of Maize Immature Embryos Mediated by Agrobacterium tumefaciens

SUN Chuan-bo，GUO Jia，YUAN Ying

（Agro-Biotechnology Research Institute， Jilin Academy of Agriculture Sciences， Changchun 130033，China）

Abstract： In order to establish genetic transformation system of maize immature embryos mediated by Agrobacterium tumefaciens， factors including size of explants， concentration of Agrobacterium tumefaciens， temperature of thermal pretreatment， infection time， cultivation and recovery time， antibiotics， screening agent affecting genetic transformation system were optimized using immature embryos of HiII as explants and GUS as reporter gene. The results showed that the size of the embryos was 1.0 to 1.5 mm in length. The OD600 nm of Agrobacterium was adjusted to 0.5 before inoculation. Pretreatment was 3 min at 40 ℃. Infection time was 8 min. It was co-cultivated 3 days and rested 4 days. 100 mg/L carbenicillin was used to eliminate Agrobacterium and bialaphos was used as selective agent. Transgenic plants were obtained by the optimized system， which was a highly and reliable system.

Key words： Agrobacterium tumefaciens-mediated method; maize（Zea mays L.）; immature embryos; genetic transformation

玉米（Zea mays L.）是重要的糧食作物和工業(yè)原料作物之一，在國民經(jīng)濟生產(chǎn)中具有重要戰(zhàn)略地位。利用基因工程技術手段創(chuàng)制性狀優(yōu)異的轉基因玉米新種質具有重要的理論和現(xiàn)實意義，為玉米育種技術開辟了新途徑。自1988年Rhodes等[1]首次獲得轉基因玉米完整植株，1996年Ishida等[2]初步建立農(nóng)桿菌遺傳轉化體系以來，玉米遺傳轉化研究得到了迅速發(fā)展，目前已有多種轉基因玉米商業(yè)化生產(chǎn)。玉米遺傳轉化的方法主要有農(nóng)桿菌介導轉化法、基因槍轉化法、合子轉化法和花粉管通道法等，農(nóng)桿菌介導轉化法和基因槍轉化法最為常用[3-5]，農(nóng)桿菌介導轉化法因具有外源基因整合位點穩(wěn)定、轉化機理清楚、轉基因后代拷貝數(shù)低、遺傳穩(wěn)定性好、實驗操作方便、成本低等優(yōu)點而更受青睞[6]。研究表明基因型和外植體是影響玉米遺傳轉化率的關鍵因素[7]，目前成功的基因型材料多為玉米A188和HiII，而幼胚因再生能力明顯高于其他部位而被廣泛應用。建立穩(wěn)定高效的遺傳轉化體系是研究轉基因玉米的關鍵，根據(jù)不同的轉化方法和受體已建立了多種體系，并獲得了抗除草劑、抗蟲、抗病、抗寒和抗旱等多種轉基因種質材料[7-15]。

本研究以具有高再生能力的玉米HiII幼胚為外植體，探索外植體大小、農(nóng)桿菌濃度、熱預處理溫度、侵染時間、共培養(yǎng)及恢復培養(yǎng)時間、抗生素、篩選劑等因素對遺傳轉化的影響，通過β-葡萄糖苷酸酶基因（GUS）瞬時表達率分析優(yōu)化各因素，集合各優(yōu)化因子建立高效穩(wěn)定的農(nóng)桿菌介導玉米幼胚遺傳轉化體系，為轉基因玉米產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供高效穩(wěn)定的轉化平臺。

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗材料

1.1.1 ?植物材料 ?玉米HiII。

1.1.2 ?植物表達載體和菌株 ?植物表達載體為pCAMBIA3301，菌株為農(nóng)桿菌EHA105。

1.1.3 ?培養(yǎng)基及成分 ?侵染培養(yǎng)基（IM）：1/2 MS鹽+1/2 MS維生素+100 mg/L肌醇+500 mg/L水解酪蛋白+200 μmol/L AS+36 g/L蔗糖+68 g/L葡萄糖，pH 5.2;繼代培養(yǎng)基（M）：MS鹽+MS維生素+100 mg/L肌醇+500 mg/L水解酪蛋白+500 mg/L L-脯氨酸+200 mg/L L-天門冬酰胺+1.5 mg/L 2，4-D+30 g/L蔗糖+8 g/L瓊脂，pH 6.0;共培養(yǎng)培養(yǎng)基（CM）：繼代培養(yǎng)基+100 μmol/L AS+850 mg/L AgNO3，pH 6.0;恢復培養(yǎng)基1（RM1）：繼代培養(yǎng)基+0.5 g/L MES+100 mg/L Car，pH 6.0;恢復培養(yǎng)基2（RM2）：繼代培養(yǎng)基+0.5 g/L MES+250 mg/L Cef，pH 6.0;選擇培養(yǎng)基1（SM1）：繼代培養(yǎng)基+1.5 mg/L Bialaphos或Glufosinate+100 mg/L Car，pH 6.0;選擇培養(yǎng)基2（SM2）：繼代培養(yǎng)基+3.0 mg/L Bialaphos或Glufosinate+100 mg/L Car，pH 6.0;分化培養(yǎng)基（FM）：繼代培養(yǎng)基+0.5 mg/L KT，pH 6.0; 生根培養(yǎng)基（GM）：繼代培養(yǎng)基+0.5 mg/L IBA+5 g/L活性炭;YEB培養(yǎng)基：10 g/L酵母提取物+10 g/L蛋白胨+5 g/L NaCl，pH 7.0。

1.2 ?方法

1.2.1 ?外植體制備 ?取授粉9～12 d左右的雌穗，剝去苞葉，將頂端切去1 cm左右后浸泡在70%乙醇中，15 min后取出并用無菌水洗凈，在超凈工作臺上剝取幼胚，幼胚大小0.5～2.0 mm，置于含有1.5 mL IM的EP管中備用，每管中含有50多個大小相同的幼胚。

1.2.2 ?外植體遺傳轉化

1）工程菌制備。將保存于-80 ℃冰箱中的農(nóng)桿菌于YEB固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，培養(yǎng)至長出直徑約 1 mm大小的單菌落，經(jīng)分子驗證后重新在YEB固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，19 ℃培養(yǎng)3 d后收集菌體，用IM懸浮，加入乙酰丁香酮（AS）至終濃度為200 μmol/L，并制備成不同濃度的工程菌備用。

2）外植體侵染。制備的幼胚，一部分經(jīng)過不同溫度水浴熱處理3 min后立刻冰浴1 min再進行轉化，一部分直接用于轉化。工程菌液的OD600 nm分別為0.2、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0，侵染時間分別為2、5、8、11、14 min，侵染結束后，棄掉菌液，將幼胚置于滅菌的濾紙上，吸去多余菌液，轉移到CM中，整個過程不能傷害幼胚。

1.2.3 ?共培養(yǎng)及恢復培養(yǎng) ?轉化后的幼胚置于CM中，21 ℃暗培養(yǎng)1～5 d。共培養(yǎng)后的幼胚，一部分轉移到RM1中，一部分轉移到RM2中，經(jīng)過4 d的恢復培養(yǎng)，其他的不經(jīng)過恢復培養(yǎng)，直接轉移到SM中進行篩選。

1.2.4 ?抗性愈傷組織的篩選 ?恢復培養(yǎng)后的幼胚轉移到SM1中，經(jīng)過14 d的篩選后轉移到SM2中，經(jīng)過3輪篩選，每輪篩選時間為14 d，最后得到抗性愈傷組織。

1.2.5 ?轉化植株的獲得及檢測

1）轉化植株的獲得。將抗性愈傷組織轉移到FM和GM中，經(jīng)過分化和生根培養(yǎng)后獲得轉化植株。

2）GUS瞬時表達檢測。幼胚用磷酸緩沖液清洗后置于GUS染色液中，37 ℃溫浴24 h，在顯微鏡下統(tǒng)計帶有藍斑的幼胚，并計算GUS瞬時表達率。GUS瞬時表達率=（有藍斑幼胚/侵染幼胚）×100%。

3）轉化植株的分子檢測。提取轉基因玉米基因組DNA[8]，進行Bar和目的基因的PCR檢測。取1 cm左右PCR陽性的轉基因植株葉片，按照試紙條檢測方法對轉基因植株進行檢測。

2 ? 結果與分析

2.1 ?外植體大小對遺傳轉化的影響

幼胚的大小直接影響遺傳轉化效果，試驗中將幼胚大小分為0.5～1.0 mm、1.0～1.5 mm、1.5～2.0 mm 3類，用OD600 nm為0.5的菌液侵染8 min，21 ℃共培養(yǎng)3 d后進行GUS檢測，結果如圖1所示。由圖1可知，幼胚大小為1.0～1.5 mm的GUS瞬時表達率最高，為12.08%，明顯高于其他幼胚的GUS瞬時表達率，因此選擇1.0～1.5 mm的幼胚作為受體材料。

2.2 ?農(nóng)桿菌濃度（OD600 nm）對遺傳轉化的影響

用OD600 nm分別為0.2、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0的菌液侵染幼胚大小為1.0～1.5 mm的外植體8 min，21 ℃共培養(yǎng)3 d后進行GUS檢測，結果如圖2所示。由圖2可知，當OD600 nm為0.5和0.6時，GUS瞬時表達率較高，二者相差很小，但高濃度的農(nóng)桿菌對幼胚傷害較大，并影響后期的愈傷誘導，因此后續(xù)試驗選擇農(nóng)桿菌菌液OD600 nm為0.5。

2.3 ?熱預處理溫度對遺傳轉化的影響

在幼胚侵染前，將浸泡在IM中的幼胚采用35、40、45、50 ℃水浴熱處理3 min后，立刻冰浴1 min，然后用OD600 nm為0.5的菌液侵染幼胚大小為1.0～1.5 mm的外植體8 min，21 ℃共培養(yǎng)3 d后進行GUS檢測，結果如圖3所示。由圖3可以看出，隨著熱處理溫度升高，GUS瞬時表達率先升高后降低，40 ℃時最高，50 ℃時較低，可能是溫度太高對幼胚造成了巨大傷害，有些幼胚甚至死亡，因此后續(xù)試驗選擇40 ℃熱處理3 min。

2.4 ?侵染時間對遺傳轉化的影響

以40 ℃水浴熱處理3 min后，立刻冰浴1 min，然后用OD600 nm為0.5的菌液分別侵染幼胚大小為1.0～1.5 mm的外植體2、5、8、11、14 min，21 ℃共培養(yǎng)3 d后進行GUS檢測，結果如圖4所示。由圖4可以看出，侵染時間對轉化體系的影響也很大，侵染8 min的GUS瞬時表達率最高，侵染5 min和11 min兩者的GUS瞬時表達率差別不大，但是后期的幼胚培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，侵染11 min比侵染5 min的農(nóng)桿菌污染嚴重，而且幼胚生長狀態(tài)不好，且不容易分化，因此后續(xù)試驗選擇侵染時間為8 min。

2.5 ?共培養(yǎng)時間和恢復培養(yǎng)對遺傳轉化的影響

以40 ℃水浴熱處理3 min后，立刻冰浴1 min，然后用OD600 nm為0.5的菌液侵染幼胚大小為1.0～1.5 mm的外植體8 min，21 ℃共培養(yǎng)1～5 d后直接進行GUS檢測或再恢復培養(yǎng)4 d后進行GUS檢測，考察共培養(yǎng)時間和恢復培養(yǎng)對遺傳轉化的影響，結果如圖5所示。由圖5可以看出，共培養(yǎng)3 d的GUS瞬時表達率最高，恢復培養(yǎng)4 d比無恢復培養(yǎng)的瞬時表達率明顯升高，因此選擇共培養(yǎng)3 d和恢復培養(yǎng)4 d。

2.6 ?抗生素和篩選劑對遺傳轉化的影響

抗生素在抑制農(nóng)桿菌的同時也影響轉化率，在恢復培養(yǎng)基中分別加入100 mg/L Car或250 mg/L Cef來抑制農(nóng)桿菌的生長，結果表明，羧芐青霉素（Car）作為抑菌劑明顯好于噻孢霉素（Cef），同時對于幼胚生長的影響也小于Cef。

在選擇培養(yǎng)基中分別使用雙丙氨膦（Bialaphos）和草胺膦（Glufosinate）為篩選劑，經(jīng)雙丙氨膦篩選的后代假陽性率低于10%，而草胺膦篩選的后代假陽性率高達70%，因此選擇雙丙氨膦作為篩選劑。

2.7 ?高效遺傳轉化體系的建立

集合各優(yōu)化因子，即幼胚大小為1.0～1.5 mm，農(nóng)桿菌菌液的OD600 nm為0.5，40 ℃熱處理3 min，侵染8 min，共培養(yǎng)3 d和恢復培養(yǎng)4 d，100 mg/L羧芐青霉素作為抑菌劑，雙丙氨膦作為篩選劑，建立的遺傳轉化體系3次試驗的GUS瞬時表達率平均為32.26%，明顯高于未優(yōu)化體系（CK）的11.90%（表1）。

2.8 ?轉基因植株分子檢測

對獲得的轉基因植株初步采用PCR檢測方法，經(jīng)Bar基因PCR檢測，1～9號轉基因材料全部為陽性;經(jīng)目的基因PCR檢測，1～8號轉基因植株為陽性（圖6）。通過Bar試紙條進行蛋白質水平檢測，3、6、7、8、9號轉基因植株為陽性，有非常清晰的檢測線出現(xiàn)（圖7）。

3 ?結論

在玉米遺傳轉化研究中，外植體的類型有很多種，幼胚因易轉化、再生能力強而被廣泛應用，幼胚的大小直接影響遺傳轉化率，本研究證明幼胚大小在1.0～1.5 mm時，GUS瞬時表達率最高，為12.08%，該結果和國內外很多研究結果相符[13-16]。高濃度菌液、長時間侵染對幼胚的傷害較大，在不影響遺傳轉化率的情況下，盡量選擇低濃度、短時間侵染，本研究證明菌液OD600 nm為0.5、侵染8 min時，GUS瞬時表達率最高。對比已建立的以胚性愈傷組織為外植體的玉米遺傳轉化體系[17]，菌液OD600 nm要小0.1，侵染時間要減少7 min。在遺傳轉化過程中共培養(yǎng)3 d后采取4 d的恢復培養(yǎng)，讓轉化材料盡早適應篩選環(huán)境，可明顯提高GUS瞬時表達率。本研究對幼胚材料進行40 ℃熱預處理3 min，GUS瞬時表達率提高1倍多，與Hiei等[18]的研究結果相比略微不同，可能是受體材料基因型不同造成的，熱處理還需要更廣泛的試驗來證明。抑菌劑不僅影響幼胚的生長發(fā)育，同時還影響遺傳轉化率，Car作為抑菌劑明顯優(yōu)于Cef，該結果與相關報道吻合[10]。在整個篩選過程中，采用雙丙氨膦作為篩選劑和采用傳統(tǒng)的草胺膦相比，大大降低了假陽性率。集合各優(yōu)化因子建立了農(nóng)桿菌介導玉米幼胚遺傳轉化體系，基于該體系已獲得多種轉基因玉米種質，分子檢測結果證實該體系具有穩(wěn)定的可重復性和高效性。該體系的建立豐富了玉米種質資源，開拓了玉米育種途徑。

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