陸紅，吳蓮鳳，林成成，王斯璐，梁勇，白永恒

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江 溫州 325015，1．醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心；2．外科實(shí)驗(yàn)室）

Hedgehog（HH）信號最早是在研究果蠅基因突變中被發(fā)現(xiàn)，主要由配體sonic hedgehog（Shh）、膜受體Patched 1（Ptch1）、信號開關(guān)蛋白Smoothened（Smo）及下游的轉(zhuǎn)錄因子Gli1組成[1]。在整個(gè)信號通路中，Shh、Smo及Gli1為正調(diào)節(jié)作用，而Ptch1則起著負(fù)調(diào)節(jié)作用。最近有研究報(bào)道，持續(xù)異常激活的HH信號可導(dǎo)致胰腺癌、器官纖維化等多種增殖性疾病的發(fā)生[2-3]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，HH信號參與了腎間質(zhì)纖維化過程，誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化和基質(zhì)累積[4-5]，然而，其機(jī)制目前尚不清楚。因此，本研究擬通過外源性重組蛋白Shh來活化HH信號，以及環(huán)杷明特異性阻斷HH信號的活化，檢測腎小管上皮細(xì)胞增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）的表達(dá)改變，旨在從體外實(shí)驗(yàn)角度觀察調(diào)控HH信號對細(xì)胞增殖的影響。

1 材料和方法

1.1 材料 DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液（美國Hyclone公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；胰蛋白酶和TRIzol提取液（美國Gibco公司）；兔抗鼠Ptch1、Smo、Gli1和PCNA單克隆抗體（美國Santa Cruz公司）；RT-PCR試劑（美國Promega公司）；重組蛋白Shh和環(huán)杷明（美國PeproTech公司）；MyCycler梯度PCR儀（美國Bio-Rod公司）；7500定量PCR儀（美國Applied Biosystens公司）；Varioskan Flash全波長多功能掃描儀（美國Thermo Scientific公司）；DM4000 B LED熒光正置顯微鏡（德國Leica公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：大鼠腎小管上皮細(xì)胞系（NRK-52E）購于中科院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。細(xì)胞培養(yǎng)條件為5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱。實(shí)驗(yàn)前，調(diào)整細(xì)胞至適當(dāng)密度并鋪板于六孔板中，當(dāng)細(xì)胞融合度為50%～70%時(shí)，開始正式實(shí)驗(yàn)。設(shè)立組別：對照組：不加入Shh和環(huán)杷明；活化組：細(xì)胞培養(yǎng)基中加入10μg/L Shh；干預(yù)組：在10μg/L Shh基礎(chǔ)上，加入5μmol/L環(huán)杷明。各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

1.2.2 real-time RT-PCR檢測mRNA表達(dá)：采用Trizol試劑盒提取各組細(xì)胞總RNA，根據(jù)RT-PCR試劑說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。針對Ptch1和Smo mRNA設(shè)計(jì)特異性引物，以β-actin作為內(nèi)參，采用real-time RT-PCR相對定量法進(jìn)行檢測。引物序列如表1所示，由上海捷瑞公司合成。取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1μL進(jìn)行定量PCR，PCR擴(kuò)增體系：5μL 2×SYBR Green熒光定量試劑、上下游引物各1μL，終濃度為200 nmol/L、1μL cDNA、2μL反應(yīng)緩沖液。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃5 min、95 ℃ 10 s、60 ℃ 35 s，40個(gè)循環(huán)。通過熔解曲線評價(jià)PCR結(jié)果可靠性，采用2-△△Ct計(jì)算相對mRNA表達(dá)量?！鳌鰿t=[Ct目的基因（待測樣品）-Ct內(nèi)參（待測樣品）]-[Ct目的基因（校正樣品）-Ct內(nèi)參（校正樣品）]。

表1 擴(kuò)增Ptch1和Smo mRNA特異性引物

1.2.3 細(xì)胞免疫熒光檢測HH信號和PCNA蛋白表達(dá)：取對數(shù)生長期NRK-52E細(xì)胞，分別加入溶劑，10μg/L Shh和10μg/L Shh基礎(chǔ)上加入5μmol/L環(huán)杷明進(jìn)行爬片培養(yǎng)24 h，吸去培養(yǎng)液，4%甲醛固定，用含0.03% Triton X-100的PBS對細(xì)胞進(jìn)行破膜。5%二抗血清封閉孵育，行一抗孵育與二抗孵育，用DAPI進(jìn)行核染，封片劑封片，置于熒光顯微鏡下觀察并圖像獲取Ptch1、Smo、Gli1和PCNA的表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果以 ±s表示，兩樣本比較采用t檢驗(yàn)和精確概率法，多組間比較用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重組蛋白Shh及環(huán)杷明對HH信號的影響 細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果顯示，對照組細(xì)胞中Ptch1表達(dá)較高，Smo和Gli1表達(dá)較低，提示HH信號活性較低。應(yīng)用10μg/L Shh作用NRK-52E細(xì)胞24 h后，Ptch1蛋白表達(dá)顯著下降，而Smo和Gli1蛋白表達(dá)顯著升高，見圖1。Real-time RT-PCR結(jié)果也顯示，Ptch1 mRNA表達(dá)下降，Smo mRNA表達(dá)升高（見表2）。這些結(jié)果提示HH信號通路被Shh活化。用環(huán)杷明進(jìn)行干預(yù)后，Ptch1表達(dá)升高，Smo和Gli1表達(dá)下調(diào)（見圖2）。此外，Ptch1 mRNA表達(dá)量也顯著上調(diào)，而Smo mRNA表達(dá)下調(diào)（見表2）。因此，Shh誘導(dǎo)NRK-52E細(xì)胞中HH信號的活化，可被環(huán)杷明所阻滯。

2.2 重組蛋白Shh及環(huán)杷明對PCNA表達(dá)的影響PCNA作為細(xì)胞增殖最重要的標(biāo)志物之一，主要定位表達(dá)于細(xì)胞核中。對照組NRK-52E細(xì)胞中PCNA的表達(dá)水平較低（見圖2a和2a’），而活化組細(xì)胞表達(dá)PCNA蛋白的水平明顯上調(diào)（見圖2b和2b’）。此結(jié)果提示，Shh活化HH信號后，可引起細(xì)胞增殖性反應(yīng)。加入環(huán)杷明后，抑制了由Shh所致的PCNA高表達(dá)（見圖2c和2c’）。此外，我們也發(fā)現(xiàn)，原本核染位置的PCNA也游離到胞漿之外，這提示環(huán)杷明可誘導(dǎo)NRK-52E細(xì)胞出現(xiàn)凋亡、壞死等形態(tài)學(xué)改變。

圖1 重組蛋白Shh及環(huán)杷明對HH信號的影響（×400）

圖2 活化和阻斷HH信號對NRK-52E細(xì)胞PCNA的影響（×400）

2.3 活化和抑制HH信號對NRK-52E細(xì)胞增殖的影響倒置相差顯微鏡下，正常的腎小管上皮細(xì)胞相互重疊生長，呈鋪路石狀；當(dāng)重組蛋白Shh作用后，腎小管上皮細(xì)胞數(shù)量增加的同時(shí)細(xì)胞形態(tài)變得不規(guī)則，且細(xì)胞邊界明顯；而當(dāng)環(huán)杷明對活化組進(jìn)行干預(yù)后，細(xì)胞變大，細(xì)胞數(shù)量減少且間隙變寬，細(xì)胞間甚至形成空洞，見圖3。這些結(jié)果提示活化HH信號對細(xì)胞增殖的影響不僅僅是細(xì)胞數(shù)目的增加，而且細(xì)胞形態(tài)也發(fā)生改變，如表型轉(zhuǎn)化。

表2 各組間Ptch1和Smo mRNA表達(dá)量的比較（n=6， ±s）

3 討論

HH信號是一條高度保守的信號通路，在哺乳動(dòng)物中，HH信號通路對于器官發(fā)育、維持成熟組織的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、慢性炎癥中的組織修復(fù)和癌癥發(fā)生等多種進(jìn)程發(fā)揮著十分重要的作用[6]。

圖3 活化和阻斷HH信號對NRK-52E細(xì)胞增殖的影響（×400）

國外研究發(fā)現(xiàn)，在梗阻性膽管疾病中，HH信號可被活化，進(jìn)而促進(jìn)膽管上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，最終導(dǎo)致膽管組織纖維化的發(fā)生[3]。我們前期研究也顯示，HH信號參與了腎間質(zhì)纖維化過程[4-5]。在體外，馬兜鈴酸可誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)和釋放TGF-β1，促進(jìn)上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，從而導(dǎo)致基質(zhì)成分I和III型膠原的過度累積[4]。在體內(nèi)，輸尿管梗阻引起了腎小管上皮細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化，進(jìn)而導(dǎo)致間質(zhì)纖維化的發(fā)生[5]。在這些過程中，HH信號均被激活[7]。然而，HH信號如何調(diào)控小管上皮細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化，其分子機(jī)制尚不十分清楚。Mill等[8]研究顯示，活化的HH信號能夠上調(diào)其轉(zhuǎn)錄靶蛋白Cyclin E和Cyclin D的表達(dá)，后兩者加快細(xì)胞G/S期的轉(zhuǎn)變，誘導(dǎo)細(xì)胞過度增殖和表型轉(zhuǎn)化。本研究中，我們通過人為誘導(dǎo)HH信號的活化，發(fā)現(xiàn)PCNA表達(dá)顯著增加。PCNA為細(xì)胞增殖信號相對較下游的標(biāo)志物，其表達(dá)水平提高，意味著細(xì)胞過度增殖。這種增殖不僅表現(xiàn)為腎小管上皮細(xì)胞數(shù)目的增加，而且細(xì)胞形態(tài)上也發(fā)生了改變。我們推測，在損傷微環(huán)境中，多種因素可誘導(dǎo)HH信號的活化。活化的HH信號誘導(dǎo)自身或周圍的上皮細(xì)胞不僅通過正常增殖維持一定的細(xì)胞數(shù)量，而且也通過異常增殖方式，轉(zhuǎn)化為耐受力更強(qiáng)的肌成纖維細(xì)胞以維持生存[9]。這種增殖方式也就是由所謂的表型轉(zhuǎn)化而形成的肌成纖維細(xì)胞能分泌膠原成分在局部累積導(dǎo)致纖維化。

環(huán)杷明是一種從藜蘆屬植物內(nèi)分離得到的異甾體類生物堿。環(huán)杷明可通過特異性改變Smo空間構(gòu)象，抑制其活性，從而抑制HH信號通路[10]。此外，環(huán)杷明與Smo結(jié)合能夠使細(xì)胞的分裂停止于G0/G1期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而抑制細(xì)胞增殖。本研究也證實(shí)了活化的HH信號可被環(huán)杷明所抑制，并且PCNA的表達(dá)也明顯下調(diào)。下調(diào)的PCNA與小管上皮細(xì)胞增殖的抑制密切相關(guān)，這結(jié)果也從形態(tài)學(xué)角度得到驗(yàn)證。鏡下我們觀察到，環(huán)杷明抑制了細(xì)胞的增殖，并且誘導(dǎo)了細(xì)胞的凋亡壞死。

綜上所述，通過干預(yù)HH信號，可以調(diào)控PCNA的表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞增殖效應(yīng)。然而，這種不僅增加細(xì)胞數(shù)目，而且也誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化的增殖性調(diào)控機(jī)制還需今后的研究加以論證。

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