童月紅，周穎，吳丹丹，傅曉艷

（1.金華市中心醫(yī)院 婦產(chǎn)科，浙江 金華 321000；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 生殖醫(yī)學(xué)中心，浙江溫州 325000；3.金華市職業(yè)技術(shù)學(xué)院 解剖學(xué)教研室，浙江 金華 321000）

卵巢組織冷凍移植技術(shù)的發(fā)展為保存女性的生殖及內(nèi)分泌功能提供了可能。但卵巢組織的來源極為有限，無法滿足如卵巢早衰等患者的自體卵巢組織冷凍移植的需求。凍融人胎卵巢組織進(jìn)行移植可成為解決這一問題的有效途徑，但將其應(yīng)用于臨床尚需大量的實(shí)驗(yàn)研究。本研究以裸鼠異體移植作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停容^不同的外源性促性腺激素作用方式對凍融人胎卵巢組織異種移植后卵泡發(fā)育的影響，為其將來作為移植供體的可行性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)收集引產(chǎn)的女性胚胎卵巢（由溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院分娩室提供，并與家屬簽署知情同意書）6例，胎齡為28～35周。本實(shí)驗(yàn)選用雌性裸鼠（BACLB/CA/nu-nu，購自中科院上海實(shí)驗(yàn)動物中心）54只，6～8周齡，體質(zhì)量17～23 g，平均（20±3.15）g，飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。實(shí)驗(yàn)動物按不同外源性促性腺激素給予方式（A、B、C）及不同時期（分別為10～14周、18～22周、26～30周）回收移植物分為9組，每組6只，共54只。

1.2 主要試劑 Leibovitz-15（購自Sigma公司），丙二醇（PROH）（購自Sigma公司），孕馬血清促性腺激素（PMSG）（購自寧波第二激素廠），人絨毛膜促性腺激素（hCG）（購自麗珠集團(tuán)），Bolin固定液、增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）試劑盒（由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供）。

1.3 方法

1.3.1 人胎卵巢組織的凍融：獲取的卵巢組織室溫下Leiboviz-15基礎(chǔ)培養(yǎng)液中切成約2 mm×3 mm×3 mm小塊，組織立即于Bolin液中固定為新鮮組。其余組織塊置于含1.5 mL PROH冷凍保護(hù)液的冷凍管中，采用Oktay等[1]提出的慢速冷凍快速復(fù)溫法操作，解凍后組織塊于Bolin液中固定為凍融組，其余組織切成約1 mm3大小用于移植，為移植組。

1.3.2 去勢及移植手術(shù)：腹腔麻醉后，去除裸鼠雙側(cè)卵巢，暴露腎臟，分別于雙側(cè)腎被膜下各移入1塊組織。凍融人胎卵巢組織異種移植后將實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分為3組（每組各18只），A組：移植術(shù)后4周開始每只隔日PMSG 5 IU經(jīng)腹腔注射至取材；B組：取材前14 d開始每只隔日經(jīng)腹腔注射PMSG 5 IU，直至取材，共7次；C組：移植術(shù)后4周開始等量0.9%氯化鈉溶液隔日經(jīng)腹腔注射至取材。分別于術(shù)后10～14周、18～22周、26～30周回收移植物，取材前36 h腹腔注射hCG 5 IU，回收的移植物立即置于Bolin溶液中固定。

1.3.3 卵泡計(jì)數(shù)：新鮮和移植后取回的卵巢組織固定Bolin液中作石蠟包埋，連續(xù)切片，厚度5μm，用蘇木素-伊紅染色。按Gougeon[2]卵泡分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行卵泡計(jì)數(shù)：單層扁平或扁平與立方混合的前顆粒細(xì)胞包繞卵母細(xì)胞為原始卵泡；單層立方形顆粒細(xì)胞包繞中間的卵母細(xì)胞為初級卵泡；兩層或以上立方形顆粒細(xì)胞包繞卵母細(xì)胞，無竇腔形成為次級卵泡；兩層以上的顆粒細(xì)胞，卵泡內(nèi)有竇腔形成為竇卵泡。原始卵泡：高倍鏡400倍下隨機(jī)觀察10個視野，計(jì)數(shù)每隔10張切片中的卵泡數(shù)。初級卵泡、次級卵泡及竇卵泡：分別計(jì)數(shù)所有切片中各階段卵泡總數(shù)。1.3.4 PCNA免疫組織化學(xué)分析：移植后回收的卵巢組織常規(guī)固定包埋，5μm連續(xù)切片，每隔10張切片取一張，按試劑盒說明進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，蘇木素復(fù)染。結(jié)果判斷：PCNA定位于細(xì)胞核內(nèi)，陽性呈棕褐色，陰性呈藍(lán)色。每張切片在400倍視野下計(jì)數(shù)5個視野，每個視野100個以上陽性細(xì)胞，計(jì)算陽性指數(shù)（陽性指數(shù)=視野內(nèi)的陽性細(xì)胞數(shù)/視野內(nèi)總細(xì)胞數(shù)×100%）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。新鮮組和凍融組卵巢組織內(nèi)卵泡計(jì)數(shù)以 ±s表示，采用配對樣本t檢驗(yàn)，各移植組間卵泡計(jì)數(shù)及PCNA陽性指數(shù)則采用多組等級資料的Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)，如差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，再進(jìn)一步進(jìn)行3組樣本秩和的兩兩比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 新鮮組和凍融組人胎卵巢組織形態(tài)學(xué)觀察

新鮮組及凍融組人胎卵巢組織中的卵泡均以原始卵泡為主，分布較均勻，絕大部分形態(tài)正常，部分原始卵泡的卵母細(xì)胞胞漿內(nèi)有空泡形成，可見卵原細(xì)胞散在分布，未見初級卵泡、次級卵泡及竇卵泡。凍融組的原始卵泡數(shù)量為（30.10±9.44）個，比新鮮組的（37.26±8.91）個少，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 移植組的檢測

2.2.1 移植物的存活：整個實(shí)驗(yàn)中無動物死亡。取材時可見腎被膜下移植物凸出腎臟表面，體積不同程度增大，呈亮白色，部分可見透明竇狀小泡（見圖1）。A、B、C各組移植物回收率分別為88.9%（32/36）、86.1%（31/36）、88.9%（32/36），存活率分別為75.0%（27/36）、77.8%（28/36）、75.0%（27/36），3組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2.2 卵泡計(jì)數(shù)：3組移植物中的原始卵泡數(shù)與新鮮組及凍融組相比均減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。3組移植物隨著移植時間的延長，卵泡呈現(xiàn)原始卵泡數(shù)目減少及生長卵泡增加趨勢。A組：與10～14周相比，26～30周移植物中的原始卵泡數(shù)減少而次級卵泡數(shù)增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。B組：各時期原始卵泡數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與10～14周及18～22周相比，26～30周移植物中的初級卵泡數(shù)及次級卵泡數(shù)均增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。C組：各時期移植物中原始卵泡數(shù)及次級卵泡數(shù)變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與10～14周相比，18～22周及26～30周移植物中的初級卵泡數(shù)增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

移植早期（10～14周）：A、B、C 3組均可觀察到初級卵泡（見圖2）及次級卵泡（見圖3）。移植中期（18～22周）：與移植早期相比，3組移植物中的原始卵泡數(shù)、初級卵泡數(shù)及次級卵泡數(shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；A、B 2組各觀察到2個和1個竇卵泡（見圖1-4）。移植晚期（26～30周）：同期B、C組移植物中的原始卵泡數(shù)較A組多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；3組移植物中的初級卵泡數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；同期A、B組移植物中的次級卵泡數(shù)較C組多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；且此期A、B、C 3組分別可見1個、2個、1個竇卵泡。各組各期原始卵泡計(jì)數(shù)具體見表1，初級卵泡計(jì)數(shù)見表2，次級卵泡計(jì)數(shù)見表3。

2.2.3 PCNA的免疫組織化學(xué)檢測：3組的移植物中呈棕褐色的陽性細(xì)胞主要表達(dá)于初級卵泡、次級卵泡顆粒細(xì)胞及卵細(xì)胞核內(nèi)；組織間質(zhì)中也可見較多陽性表達(dá)細(xì)胞存在；偶見原始卵泡中體積增大、呈立方形的前顆粒細(xì)胞呈陽性表達(dá)（見圖5-6）。定位陽性表達(dá)細(xì)胞于初級卵泡、次級卵泡顆粒細(xì)胞及卵細(xì)胞核，A、B、C 3組移植物PCNA陽性指數(shù)分別為55%～88%、52%～85%、46%～80%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

在卵巢組織的冷凍研究中，采用冷凍劑PROH及程序化冷凍法[3-4]，可獲得較為穩(wěn)定的效果。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)凍融后人胎卵巢組織中仍存大量的原始卵泡，移植后卵泡的生長及PCNA的良好表達(dá)也進(jìn)一步證實(shí)組織功能的完整性。但本研究結(jié)果示人胎卵巢組織移植后喪失的原始卵泡達(dá)50%以上，與成年[5]及青春前期[6]的人卵巢組織相比有差距，如何提高移植后組織內(nèi)的卵泡的數(shù)量我們將繼續(xù)研究。

表1 各組不同時期回收移植物中的原始卵泡數(shù)計(jì)數(shù)（ ±s，個）

表2 各組不同時期回收移植物中的初級卵泡計(jì)數(shù)（ ±s，個）

表3 各組不同時期回收移植物中的次級卵泡計(jì)數(shù)（ ±s，個）

圖1 回收的人胎卵巢組織（T示移植物，其中可見竇卵泡，K示裸鼠腎臟）

圖4 術(shù)后22周回收移植物內(nèi)可見竇卵泡發(fā)育（HE，×200）

圖2 術(shù)后10周回收移植物內(nèi)可見初級卵泡（HE，×400）

圖5 A組18周回收移植物的PCNA染色（×400）

圖3 術(shù)后14周回收移植物內(nèi)可見次級卵泡（HE，×400）

圖6 C組18周回收移植物的PCNA染色（×400）

人胎卵巢組織中存在的大量原始卵泡，且組織中所含較低的人類器官移植相關(guān)的抗原及較高的血管源性和神經(jīng)源性因子，適用于異體移植。目前人胎卵巢研究的重要問題是促進(jìn)更多數(shù)量卵泡的成熟發(fā)育及延長移植物存活時間。移植物的激素環(huán)境是影響卵泡發(fā)育的重要因素。既往關(guān)于外源性促性腺激素方案與異體移植后卵巢組織內(nèi)卵泡發(fā)育的實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在矛盾，因研究物種及選擇激素作用方式的不同相關(guān)。Pisani等[7]在以SCID鼠為模型的豬卵巢同種異體移植實(shí)驗(yàn)中，持續(xù)作用的外源性促性腺激素對卵泡的發(fā)育并沒有顯示出顯著作用；Gook等[8]卵巢異種移植中卻顯示外源性促性腺激素可促進(jìn)組織中更多卵泡發(fā)育。為探索外源性促性腺激素對人胎卵巢組織異種移植的影響，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了兩種不同的激素作用方式，一種是根據(jù)文獻(xiàn)報道所采用的外源性促性腺激素持續(xù)作用方式（即A組采用的方式），另一種是試圖模擬成人促排卵激素作用方式（即B組采用的方式）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，即使缺乏外源性促性腺激素作用，卵泡仍能發(fā)育至竇卵泡階段；不管何種作用方式，外源性促性腺激素對異種移植后人胎卵巢組織中卵泡生長的促進(jìn)作用，不同于Pisani等[7]研究，與Gook等[8]結(jié)果類似，且外源性激素對初級卵泡以上的卵泡生長促進(jìn)作用更為顯著。推測原因?yàn)楫惙N移植的人胎卵巢組織中大部分為原始卵泡，該階段卵泡需經(jīng)非激素依賴生長啟動階段，外源性促性腺激素持續(xù)作用主要作用于卵泡生長啟動后階段，對兩層顆粒細(xì)胞以上的卵泡起關(guān)鍵作用，故在卵泡生長啟動前階段其促生長作用是有限的。但本實(shí)驗(yàn)觀察到，人胎卵巢組織長期移植后存在一定數(shù)量的生長啟動卵泡及初級卵泡，由于外源性促性腺激素持續(xù)作用和促排卵激素作用方式都主要作用于此類卵泡，故二者均獲得較好的卵泡發(fā)育結(jié)果。由于部分學(xué)者[9]認(rèn)為外源性激素在卵巢移植過程中發(fā)揮促進(jìn)顆粒細(xì)胞的有絲分裂及抑制凋亡的作用，同時對卵巢間質(zhì)細(xì)胞分化起作用[10]，因此盡管外源性促性腺激素持續(xù)作用與促排卵激素作用方式?jīng)]有差別，所以有學(xué)者仍建議長期采用該方式。但本實(shí)驗(yàn)中兩種激素作用方式下的PCNA陽性差異也不明顯。又有學(xué)者[11]提出，外源性促性腺激素的長期使用會大量消耗移植組織內(nèi)原始卵泡儲備，造成移植物維持時間的縮短。本實(shí)驗(yàn)還觀察到，移植后期外源性促性腺激素持續(xù)作用后組織中的原始卵泡數(shù)下降，而促排卵激素作用方式下的組織中原始卵泡數(shù)變化相對不明顯。故雖兩種激素作用者均可獲得較好的卵泡發(fā)育結(jié)果，但促排卵激素作用方式對原始卵泡儲備造成的影響可能更小。

綜上所述，去勢的雌性裸鼠體內(nèi)的促性腺激素水平已達(dá)卵泡發(fā)育所需，外源性促性腺激素持續(xù)作用方式及促排卵激素用方式均可進(jìn)一步促進(jìn)異種移植后凍融人胎卵巢組織中卵泡的發(fā)育。但本實(shí)驗(yàn)最終均未見黃體組織，需考慮移植后組織中的竇卵泡是否存在成熟及排卵障礙，而不同的激素作用方式對卵子質(zhì)量[12]的影響等問題均需進(jìn)一步研究闡明。

[1] Oktay K, Newton H, Aubard Y, et al. Cryopreservation of immature human oocytes and ovarian tissue: an emerging technology?[J]. Fertil Steril, 1998, 69(1): 1-7.

[2] Gougeon A. Dynamics of follicular growth in the human: a model from preliminary results[J]. Hum Reprod, 1986, 1(2):81-87.

[3] Abir R, Biron-Shental T, Orvieto R, et al. Transplantation of frozen-thawed late-gestational-age human fetal ovaries into immunodefi cient mice[J]. Fertil Steril, 2009, 92(2): 770-777.

[4] 傅曉艷, 周穎, 韓海艷. 不同冷凍保護(hù)劑對凍融人卵巢組織形態(tài)學(xué)的影響[J]. 溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 2005, 35(05): 369-72.

[5] Oktay K, Newton H, Gosden RG. Transplantation of cryopreserved human ovarian tissue results in follicle growth initiation in SCID mice[J]. Fertil Steril, 2000, 73(3): 599-603.

[6] Luyckx V, Scalercio S, Jadoul P. Evaluation of cryopreserved ovarian tissue from prepubertal patients after longterm xenografting and exogenous stimulation[J]. Fertil Steril,2013, 100(5): 1350-1357.

[7] Pisani LF, Pennarossa G, Papasso Brambilla E, et al, Newborn pig ovarian tissue xenografted into Severe Combined Immunodefi cient (SCID) mice acquires limited responsiveness to gonadotropins[J]. Theriogenology, 2010, 74(4): 557-562.

[8] Gook DA, McCully BA, Edgar DH, et al. Development of antral follicles in human cryopreserved ovarian tissue following xenografting[J]. Hum Reprod, 2001, 16(3): 417-422.

[9] Petroianu A, Alberti LR, Vasconcellos LS. Morphologic,endocrinologic and natural pregnancy assessment of allogeneic ovarian orthotopic transplantation without a vascular pedicle in rabbits[J]. Eur J of Obstet Gynecol Reprod Biol 2007, 133(1): 70-75.

[10] Demeestere I, Streiff AK, Suzuki J, et al. Follicle-stimulating hormone accelerates mouse oocyte development in vivo[J]. Biol Reprod, 2012, 87(1): 3,1-11.

[11] Maltaris T, Beckmann MW, Mueller A, et al. Signifi cant loss of primordial follicles after prolonged gonadotropin stimulation in xenografts of cryopreserved human ovarian tissue in severe combined immunodeficient mice[J]. Fertil Steril 2007, 87(1): 195-197.

[12] Kaneko H, Kikuchi K, Noguchi J. Effects of gonadotrophin treatments on meiotic and developmental competence of oocytes in porcine primordial follicles following xenografting to nude mice[J]. Reprod, 2006, 131(2): 279-288.