王堅(jiān)，徐菁，李鵬，朱軍

(1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院藥學(xué)部，十堰 442008；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院藥物分析與篩選研究所，十堰 442008)

多波長(zhǎng)HPLC梯度洗脫法同時(shí)測(cè)定菠白散中4種成分含量

王堅(jiān)1，2，徐菁1，2，李鵬1，2，朱軍1，2

(1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院藥學(xué)部，十堰 442008；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院藥物分析與篩選研究所，十堰 442008)

目的 建立同時(shí)測(cè)定菠白散中肉桂酸、1，4-二[4-(葡萄糖氧)芐基]-2-異丁基蘋果酸酯(militarine)、二去氫對(duì)葉百部堿和氧化對(duì)葉百部堿含量的方法。方法 采用多波長(zhǎng)高效液相(HPLC)梯度洗脫法，Hypersil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流速：0.9 mL·min-1；流動(dòng)相A為甲醇-乙腈(3：2)，流動(dòng)相B為0.1%磷酸溶液；檢測(cè)波長(zhǎng)λ1=285 nm(肉桂酸)，λ2=223 nm(militarine)，λ3=237 nm(二去氫對(duì)葉百部堿和氧化對(duì)葉百部堿)。結(jié)果 肉桂酸在0.014 2～0.284 0 μg(r=0.999 2)、militarine在0.235 6～4.712 0 μg(r=0.999 7)、二去氫對(duì)葉百部堿在0.018 8～0.376 0 μg(r=0.999 5)、氧化對(duì)葉百部堿在0.027 4～0.548 0 μg(r=0.999 8)范圍內(nèi)，均呈良好的線性關(guān)系；肉桂酸、militarine、二去氫對(duì)葉百部堿和氧化對(duì)葉百部堿的平均加樣回收率分別為96.92%，98.57%，98.06%，97.66%，RSD(n=6)分別為0.84%，1.23%，1.24%，0.76%。結(jié)論 該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏、重復(fù)性好，可作為菠白散的含量控制方法。

菠白散；肉桂酸；1，4-二[4-(葡萄糖氧)芐基]-2-異丁基蘋果酸酯；二去氫對(duì)葉百部堿；氧化對(duì)葉百部堿

菠白散處方源自國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第十冊(cè)，內(nèi)容物為灰白色的粉末；味甘、辛、微苦。由白及、百部和菠菜子3味藥物組成，具有潤(rùn)肺、祛痰功效，是治療痰中帶血、午后發(fā)熱、咳嗽等癥狀的首選藥物之一。原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅對(duì)藥物的性狀進(jìn)行了規(guī)定，未對(duì)處方中的任何藥物進(jìn)行定性或定量測(cè)定[1-2]，難以確保產(chǎn)品質(zhì)量和療效。筆者采用多波長(zhǎng)HPLC梯度洗脫法對(duì)白及中的肉桂酸、1，4-二[4-(葡萄糖氧)芐基]-2-異丁基蘋果酸酯(militarine)和百部中的二去氫對(duì)葉百部堿、氧化對(duì)葉百部堿等4種成分進(jìn)行含量測(cè)定方法研究，為完善該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。多波長(zhǎng)高效液相(HPLC)梯度洗脫法具有適用范圍廣、快速、檢驗(yàn)費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)，已逐漸應(yīng)用于多成分的同時(shí)測(cè)定。本方法穩(wěn)定性好、精密度高，可作為菠白散的質(zhì)量控制方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1200 高效液相色譜儀(G1311A四元泵、G1330B自動(dòng)進(jìn)樣器恒溫器、G1322A脫氣機(jī)、Chemstation色譜工作站、G1315B可變波長(zhǎng)檢測(cè)器)；梅特勒電子天平(型號(hào)：XP205，感量：0.01 mg)。

1.2 試藥 肉桂酸對(duì)照品購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院(批號(hào)：110786-200503，含量：100%，置五氧化二磷減壓干燥器中干燥12 h后使用)；二去氫對(duì)葉百部堿對(duì)照品購(gòu)于上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司(批號(hào)：106861-40-9，含量：98.0%)；氧化對(duì)葉百部堿購(gòu)于上海順勃生物工程技術(shù)有限公司(批號(hào)：20675-62-1，含量：98.0%)；militarine對(duì)照品購(gòu)于上海田源生物技術(shù)有限公司(批號(hào)：E-0847，含量：98.0%)；菠白散(市售；規(guī)格：每袋裝10 g；批號(hào)：140203，140204，140205)；陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)所用藥材均購(gòu)于武漢市神草中藥飲片有限責(zé)任公司，經(jīng)檢驗(yàn)均符合各自藥材國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求；甲醇、乙腈(色譜純，湖北杜克化學(xué)科技有限公司)；磷酸(分析純，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：依利特 Hypersil C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流速為0.9 mL·min-1；流動(dòng)相A為甲醇-乙腈(3：2)，流動(dòng)相B為0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫(0～26 min，28.0%A；26～42 min，28.0%→42.0%A；42～52 min，42.0%→50.0%A；52～60 min，50.0%→28.0%A)[3-7]；檢測(cè)波長(zhǎng)[0～26 min，λ1=285 nm(肉桂酸)[8]；26～42 min，λ2=223 nm(militarine)[9-10]；42～60 min，λ3=237 nm(二去氫對(duì)葉百部堿和氧化對(duì)葉百部堿)[11]]；柱溫為室溫。此系統(tǒng)條件下所測(cè)組分與其他組分分離效果良好，理論塔板數(shù)按各組分計(jì)均不得低于2 500，分離度均>2.0。

2.2 樣品制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液配制 分別精密稱取肉桂酸、二去氫對(duì)葉百部堿和氧化對(duì)葉百部堿各適量，分別置于3個(gè)20 mL量瓶中，加70%甲醇溶解并稀釋至刻度，再分別精密吸取上述溶液各2 mL置于50 mL量瓶中，加入精密稱定后的militarine對(duì)照品適量，加70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液(肉桂酸為0.014 2 mg·mL-1，militarine為0.235 6 mg·mL-1，二去氫對(duì)葉百部堿為0.018 8 mg·mL-1，氧化對(duì)葉百部堿為0.027 4 mg·mL-1)。

2.2.2 供試品溶液的制備 取菠白散適量，研細(xì)，取約3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流2.0 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.3 陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn) 按菠白散處方比例稱取除白及的其余藥味和除百部的其余藥味各一份，分別粉碎成細(xì)粉，過篩，混勻，分別制成白及空白樣品和百部空白樣品，按照上述供試品溶液的配制方法制成白及空白溶液和百部空白溶液。分別精密吸取10 μL的供試品溶液、混合對(duì)照品溶液、白及空白溶液和百部空白溶液，按上述方法測(cè)定，結(jié)果為：在與肉桂酸、militarine、二去氫對(duì)葉百部堿和氧化對(duì)葉百部堿對(duì)照品色譜圖相應(yīng)的保留時(shí)間處，供試品溶液色譜圖中有吸收峰；而白及空白溶液色譜圖中未顯示肉桂酸和militarine吸收峰；百部空白溶液色譜圖中未顯示二去氫對(duì)葉百部堿和氧化對(duì)葉百部堿吸收峰，色譜圖見圖1。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 分別精密吸取混合對(duì)照品溶液1.0，5.0，10.0，15.0，20.0 μL，依次注入高效液相色譜儀中，按上述色譜條件進(jìn)行分析測(cè)定，以峰面積(Y)與進(jìn)樣量(X)進(jìn)行線性回歸，得肉桂酸回歸方程為：Y=1.821 3×106X+216.8，r=0.999 2，線性范圍為0.014 2～0.284 0 μg；militarine回歸方程為：Y=2.195 2×106X-594.7，r=0.999 7，線性范圍為0.235 6～4.712 0 μg；二去氫對(duì)葉百部堿回歸方程為：Y=1.697 1×106X+316.4，r=0.999 5，線性范圍為0.018 8～0.376 0 μg；氧化對(duì)葉百部堿回歸方程為：Y=2.587 2×106X+361.2，r=0.999 8，線性范圍為0.027 4～0.548 0 μg。結(jié)果表明：肉桂酸、militarine、二去氫對(duì)葉百部堿和氧化對(duì)葉百部堿在各自的線性范圍內(nèi)，進(jìn)樣量與峰面積線性關(guān)系良好。

A.白及空白溶液；B.百部空白溶液；C.對(duì)照品；D.樣品；1.氧化對(duì)葉百部堿；2.二去氫對(duì)葉百部堿；3.肉桂酸；4.militarine

圖1 4種溶液的HPLC圖

2.3.2 精密度實(shí)驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)混合對(duì)照品溶液按照“2.1”項(xiàng)色譜條件，精密吸取混合對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，分別測(cè)得4種成分的峰面積，計(jì)算各成分RSD分別為0.83%(肉桂酸)、0.46%(militarine)、0.51%(二去氫對(duì)葉百部堿)和0.39%(氧化對(duì)葉百部堿)。結(jié)果表明，儀器精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 稱取同一批號(hào)供試品，按“2.2.2”項(xiàng)供試品溶液制備方法制備供試品溶液6份，按照“2.1”項(xiàng)色譜條件依法進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算各成分含量的RSD分別為0.95%(肉桂酸)、0.64%(militarine)、0.35%(二去氫對(duì)葉百部堿)和0.52%(氧化對(duì)葉百部堿)。結(jié)果表明，本方法測(cè)定重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液，在室溫下放置0，2，4，8，12，24 h后，每次進(jìn)樣10 μL，測(cè)定其峰面積值，求得各組分RSD分別為0.79%(肉桂酸)、0.27%(militarine)、0.55%(二去氫對(duì)葉百部堿)和0.48%(氧化對(duì)葉百部堿)。表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已知含量的同一批菠白散(肉桂酸為0.246 mg·g-1、militarine為3.94 mg·g-1，二去氫對(duì)葉百部堿為0.312 mg·g-1，氧化對(duì)葉百部堿為0.459 mg·g-1)適量，研細(xì)，混勻，取約1.5 g，精密稱定，精密加入混合對(duì)照品溶液25 mL和70%甲醇25 mL，按“2.2.2”項(xiàng)供試品溶液的配制方法制備加樣供試品試液。按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算各組分回收率，結(jié)果見表1。

表1 肉桂酸、militarine、二去氫對(duì)葉百部堿和氧化對(duì)葉百部堿回收率實(shí)驗(yàn)

2.4 樣品測(cè)定 取3個(gè)批號(hào)的樣品，按“2.2.2”項(xiàng)供試品制備方法，按“2.1”項(xiàng)的色譜條件測(cè)定本品中肉桂酸、militarine、二去氫對(duì)葉百部堿和氧化對(duì)葉百部堿含量，結(jié)果見表2。

批號(hào)肉桂酸militarine1402030.246±0.0023.94±0.041402040.267±0.0034.26±0.031402050.232±0.0023.81±0.03批號(hào)二去氫對(duì)葉百部堿氧化對(duì)葉百部堿1402030.312±0.0020.459±0.0021402040.307±0.0030.424±0.0041402050.331±0.0010.473±0.003

3 討論

3.1 供試品溶液提取方法的選擇 在供試品溶液制備過程中，曾考察了超聲提取20，40，60 min和加熱回流提取2.0 h對(duì)提取效果的影響，結(jié)果超聲提取20 min各組分含量極低，超聲提取40 min和超聲提取60 min所測(cè)結(jié)果相當(dāng)，但均明顯小于加熱回流2.0 h的含量，故選用加熱回流2.0 h作為供試品溶液制備的提取方法。

3.2 色譜條件的選擇 比較不同流動(dòng)相的分離效果，以乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相時(shí)，militarine峰與后一個(gè)峰的分離不佳；以甲醇-水為流動(dòng)相時(shí)，肉桂酸峰的對(duì)稱性差，拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重。而以甲醇-乙腈(3：2)與0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相梯度洗脫時(shí)，所測(cè)4種組分均能達(dá)到基線分離，各組分峰型良好。

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關(guān)于啟用《科技期刊學(xué)術(shù)不端文獻(xiàn)檢測(cè)系統(tǒng)》的說(shuō)明

為了保證學(xué)術(shù)論文的真實(shí)性與原創(chuàng)性，抵制論文抄襲與剽竊、偽造、篡改、不當(dāng)署名、一稿多投等學(xué)術(shù)界的不正之風(fēng)，本著對(duì)《醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)》論文作者和讀者負(fù)責(zé)任的態(tài)度，本刊于2010年1月開始啟用《科技期刊學(xué)術(shù)不端文獻(xiàn)檢測(cè)系統(tǒng)(AMLC)》。該系統(tǒng)以《中國(guó)學(xué)術(shù)文獻(xiàn)網(wǎng)絡(luò)出版總庫(kù)》為全文比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)，本刊編輯對(duì)作者投來(lái)的稿件，在同時(shí)送給兩位同行專家審閱之前使用該系統(tǒng)對(duì)稿件的文字復(fù)制情況進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果包括與已發(fā)表論文比對(duì)后的文字復(fù)制比例，所涉及論文的題目、作者、發(fā)表期刊和發(fā)表時(shí)間。按規(guī)定文字復(fù)制比超過30%的來(lái)稿即疑有學(xué)術(shù)不端行為，將不能進(jìn)入下一步審稿程序，特此提醒廣大投稿作者，注意所投稿件的原創(chuàng)性與真實(shí)性。特此說(shuō)明。

《醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)》編輯部

2014-04-21

2014-09-12

王堅(jiān)(1975-)，女，湖北十堰人，主管藥師，學(xué)士，主要從事醫(yī)院藥學(xué)工作。電話：0719-8272355，E-mail：wanjianlunwen@163.com。

朱軍(1970-)，男，湖北十堰人，副主任藥師，碩士，主要從事醫(yī)院藥學(xué)及臨床藥學(xué)工作。電話：0719-8272348，E-mail：zhujunlunwen@163.com。

R286；R927.2

B

1004-0781(2015)09-1209-04

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.09.025