甘秀海，梁志遠(yuǎn)，周欣，趙超，衛(wèi)鋼

(1.貴州師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，貴陽(yáng) 550018；2.貴州師范大學(xué)天然藥物質(zhì)量控制研究中心，貴陽(yáng) 550001；3.澳大利亞聯(lián)邦科學(xué)與工業(yè)研究組織材料科學(xué)與工程分部，新南威爾士 2070)

·藥物制劑與藥品質(zhì)量控制·

百尾參藥材高效液相色譜指紋圖譜分析*

甘秀海1，梁志遠(yuǎn)1，周欣2，趙超2，衛(wèi)鋼3

(1.貴州師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，貴陽(yáng) 550018；2.貴州師范大學(xué)天然藥物質(zhì)量控制研究中心，貴陽(yáng) 550001；3.澳大利亞聯(lián)邦科學(xué)與工業(yè)研究組織材料科學(xué)與工程分部，新南威爾士 2070)

目的建立百尾參藥材的高效液相色譜指紋圖譜。方法采用高效液相色譜法，以Agilent Zorbax SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)為色譜柱，以甲醇-0.05%磷酸為流動(dòng)相，梯度洗脫，流速為1 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)256 nm，柱溫為30 ℃。結(jié)果建立了15批不同產(chǎn)地的百尾參藥材指紋圖譜，共標(biāo)定13個(gè)分離度較好的共有峰，利用對(duì)照品指認(rèn)4個(gè)共有峰；用聚類分析和主成分分析對(duì)指紋圖譜進(jìn)行化學(xué)模式識(shí)別研究。結(jié)論該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可作為百尾參藥材質(zhì)量控制的手段。

百尾參；色譜法，高效液相；指紋圖譜；相似度；聚類分析

百尾參為百合科Liliaceae萬(wàn)壽竹屬植物萬(wàn)壽竹(Disporumcantoniense(Lour.)Merr.)。其味甘、淡，性平，具有祛風(fēng)濕、舒筋活血、清熱祛痰止咳的功效[1]。百尾參為貴州省特色藥用植物，是苗族習(xí)用藥材，主要以根入藥，民間廣泛應(yīng)用于祛痰止咳，也是百靈藥業(yè)咳速停系列止咳藥物中的主藥材之一，該藥在醫(yī)院臨床應(yīng)用較廣泛。目前關(guān)于百尾參化學(xué)成分及生物活性研究有相關(guān)的報(bào)道[2-5]，其中含有酰胺、黃酮及甾體類化合物，但未見(jiàn)其質(zhì)量控制研究方面的報(bào)道。由文獻(xiàn)可知酰胺類化合物鈍葉扁柏氨基甲酸酯A(obtucarbamate A，CAS：6935-99-5)、鈍葉扁柏氨基甲酸酯B(obtucarbamate B，CAS：20913-18-2)具有明顯的止咳活性；另外槲皮素、大黃素具有較好抗菌活性。因此，為了評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地百尾參藥材的品質(zhì)，保障咳速停系列止咳藥物的內(nèi)在質(zhì)量，筆者在本實(shí)驗(yàn)中采用高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)以obtucarbamate A、obtucarbamate B、槲皮素和大黃素為對(duì)照品對(duì)百尾參藥材指紋圖譜進(jìn)行研究[6]，并通過(guò)《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》計(jì)算不同產(chǎn)地百尾參藥材的相似度，采用聚類分析和主成分分析對(duì)指紋圖譜進(jìn)行化學(xué)模式識(shí)別研究，為建立百尾參藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Dionex-Ultimate 3000型高效液相色譜儀(美國(guó)戴安公司，四元泵，自動(dòng)進(jìn)樣器，多薄層紫外檢測(cè)器，柱溫箱)；DZF-6020型真空干燥箱(杭州藍(lán)天化驗(yàn)儀器廠)；DFY-200型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司)；AL204型電子分析天平(梅特勒-托利多公司，感量：0.1 mg)；HH-6型電熱恒溫水浴鍋(金壇市榮華儀器制造有限公司)；EM-202 MS1型微波真空干燥機(jī)(合肥榮事達(dá)三洋電器股份有限責(zé)任公司)。

1.2 試藥 15批百尾參樣品信息見(jiàn)表1，經(jīng)貴州師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院朱富壽教授鑒定為百尾參(Disporumcantoniense)的根莖；obtucarbamate A、obtucarbamate B、槲皮素、大黃素對(duì)照品，本課題組自制，純度均>99%(HPLC歸一化法測(cè)定)；流動(dòng)相甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

表1 百尾參樣品來(lái)源

Tab.1 Sources ofDisporumcantoniensesamples

樣品產(chǎn)地采集時(shí)間S1貴州思南2012年9月S2貴州貴陽(yáng)烏當(dāng)2012年10月S3貴州安順2012年8月S4貴州獨(dú)山2012年8月S5貴州關(guān)嶺2012年10月S6貴州貴定2012年9月S7貴州貴陽(yáng)花溪2012年8月S8貴州凱里2012年10月樣品產(chǎn)地采集時(shí)間S9貴州雷山2012年8月S10貴州龍里2012年9月S11貴州盤(pán)縣2012年8月S12貴州習(xí)水2012年10月S13貴州玉屏2012年10月S14貴州織金2012年8月S15貴州遵義2012年9月

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱Agilent Zorbax SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以甲醇(A)-0.05%磷酸(B)為流動(dòng)相，按表2中的梯度進(jìn)行洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)256 nm；柱溫30 ℃；流速1 mL·min-1；供試品及對(duì)照品進(jìn)樣量10 μL；分析時(shí)間71 min。

表2 流動(dòng)相梯度表 Tab.2 Gradient of mobile phase

2.2 混合對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取恒重后的obtucarbamate A 3.5 mg、obtucarbamate B 1.1 mg、槲皮素2.8 mg、大黃素1.2 mg置100 mL量瓶中，加甲醇定容并搖勻，即得對(duì)照品溶液，進(jìn)樣前過(guò)孔徑0.45 μm濾膜，用以定位色譜峰位置。

2.3 供試品溶液的制備 取過(guò)篩孔內(nèi)徑0.425 mm篩的藥材粉末2.0 g，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，精密加入80%乙醇40 mL，于80 ℃水浴回流提取2.0 h，濾過(guò)，濃縮，加水10 mL分配，再用乙酸乙酯每次15 mL萃取3次，合并有機(jī)相，揮干，用甲醇定容至10 mL量瓶中，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度實(shí)驗(yàn) 取同一供試品溶液(S1)，按“2.1”項(xiàng)下方法連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄特征圖譜，采用國(guó)家藥典委員會(huì)《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》(2004A版)進(jìn)行評(píng)價(jià)，相似度均>0.95，符合特征圖譜技術(shù)要求，表明儀器的精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一供試品溶液(S1)，按“2.1”項(xiàng)下方法在0，2，4，8，16，24 h分別進(jìn)樣測(cè)定，采用國(guó)家藥典委員會(huì)《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》(2004A版)進(jìn)行評(píng)價(jià)，相似度均>0.95，符合特征圖譜技術(shù)要求，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 分別取S1樣品6份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。采用國(guó)家藥典委員會(huì)《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》(2004A版)對(duì)結(jié)果進(jìn)行相似度分析，結(jié)果表明相似度均>0.95，說(shuō)明方法重復(fù)性良好。

2.5 指紋圖譜的建立及評(píng)價(jià)

2.5.1 指紋圖譜的建立及共有峰的標(biāo)定 分別取S1～S15樣品按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分析，記錄色譜圖。利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》(2004年A版)軟件，以樣品S1的色譜圖為參照?qǐng)D譜，采用自動(dòng)匹配法生成對(duì)照?qǐng)D譜R(圖1)。分析各樣品之間的共有峰并標(biāo)定共有峰，結(jié)果確定了15批樣品有13個(gè)分離度較好的共有峰(圖2A)，通過(guò)與對(duì)照品色譜圖(圖2B)比較指認(rèn)圖譜中的5號(hào)峰為obtucarbamate B，保留時(shí)間為28.99 min，6號(hào)峰為obtucarbamate A，保留時(shí)間為34.92 min，8號(hào)峰為槲皮素，保留時(shí)間為38.31 min，13號(hào)峰為大黃素，保留時(shí)間為61.35 min。

2.5.2 相似度評(píng)價(jià)分析 將對(duì)照用指紋圖譜及15批百尾參樣品圖譜導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》(2004年A版)軟件，采用相關(guān)系數(shù)法對(duì)樣品總色譜峰進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，通過(guò)與共有模式比較，各樣品色譜圖相與對(duì)照?qǐng)D譜R的相似度結(jié)果見(jiàn)表3，除貴州貴定樣品(S6)外，其余樣品與對(duì)照?qǐng)D譜R的相似度均>0.9。以6號(hào)峰(obtucarbamate A)參照峰，設(shè)其相對(duì)保留時(shí)間和峰面積為1，計(jì)算各共有峰對(duì)它的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示，15批百尾參共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD較小，均<1.00%，但相對(duì)峰面積的RSD較大(32.08%～181.85%)，表明百尾參藥材的主要成分相似，但各成分的含量差別較大，說(shuō)明產(chǎn)地不同對(duì)藥材中各成分的含量影響較大。見(jiàn)表4，5。

圖1 15批百尾參藥材HPLC指紋圖譜

Fig.1 HPLC fingerprints for 15 batches ofDisporumcantoniensesamples

2.6 化學(xué)模式識(shí)別

2.6.1 聚類分析 利用SPSS17版數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件，選取13個(gè)共有峰面積為變量，采用組間連接法，以歐氏距離平方和作為測(cè)度對(duì)樣品聚類，結(jié)果如圖3。由樹(shù)狀圖中可以看出，15批樣品聚為2類，S6聚為一類(B類)，其余樣品聚為一類(A類)，與相似度分析結(jié)果相符。

2.6.2 主成分分析 各樣品經(jīng)分析得到色譜數(shù)據(jù)，通過(guò)相對(duì)保留時(shí)間定位，以對(duì)應(yīng)的峰面積的積分值作為數(shù)據(jù)源，形成樣本數(shù)據(jù)矩陣，采用SPSS 17版統(tǒng)計(jì)軟件分析，以主成分PC1和PC2所組成的平面投影圖見(jiàn)圖4。由圖4可知，樣品S6更加接近PC2，單獨(dú)列為一類；其他批次樣品游離主體分布投影群，被視為一類。這一統(tǒng)計(jì)結(jié)果與聚類分析、相似度分析結(jié)果基本一致。

5.鈍葉扁柏氨基甲酸酯B；6.鈍葉扁柏氨基甲酸酯A；8.槲皮素；13.大黃素

圖2 百尾參藥材共有模式(A)及混合對(duì)照品(B)HPLC圖譜

5.obtucarbamate B；6.obtucarbamate A；8.quercetin；13.emodin

Fig.2 HPLC chromatograms of common mode(A) and mixed reference(B) ofDisporumcantoniense

表3 樣品特征圖譜與共有特征圖譜R的相似度

Tab.3 Similarity of characteristic peaks of samples and common characteristic peaks of R

樣品相似度S10．967S20．923S30．904S40．977S50．918S60．547S70．957S80．977樣品相似度S90．944S100．969S110．928S120．954S130．994S140．901S150．992

表4 百尾參特征圖譜共有峰相對(duì)保留時(shí)間 Tab.4 Relative retention time of common peaks of characteristic chromatograms for Disporum cantoniense

表5 百尾參特征圖譜共有峰相對(duì)峰面積 Tab.5 Relative peak areas of common peaks of characteristic chromatograms for Disporum cantoniense

圖3 聚類分析樹(shù)狀圖

3 討論

3.1 供試品制備方法的優(yōu)化 考慮到百尾參的化學(xué)成分，筆者在本實(shí)驗(yàn)中分別考察了不同溶媒、不同提取方法色譜圖的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)80%乙醇加熱回流，經(jīng)乙酸乙酯萃取后的供試品所得的色譜峰數(shù)目較多，分離度較好，因此優(yōu)選80%乙醇加熱回流再經(jīng)乙酸乙酯萃取為供試品的前處理方法。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 為了獲得樣品全面的色譜信息，筆者在本實(shí)驗(yàn)中分別對(duì)比較了波長(zhǎng)210，230，256，

圖4 主成分分析平面投影圖

280，310，330，360 nm下的色譜圖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)210 和230 nm下的色譜圖峰最多，但基線漂移；而280，310，330和360 nm下的色譜圖峰較少，無(wú)法全面反映藥材的成分；256 nm下的色譜圖峰較多，分離度最好，固選擇256 nm為樣品的檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 流動(dòng)相的優(yōu)化 為了得到分離度較好的色譜圖，筆者在本實(shí)驗(yàn)中分別考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.05%磷酸、甲醇-0.2%乙酸等流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行等度和梯度洗脫對(duì)色譜峰的影響。結(jié)果顯示以甲醇-0.05%磷酸為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，能得到分離度較好且峰型對(duì)稱的色譜圖。

3.4 指紋圖譜評(píng)價(jià)與分析 由中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件分析結(jié)果可知，不同產(chǎn)地百尾參藥材的主要成分相似，但各成分的含量差別較大，說(shuō)明產(chǎn)地不同對(duì)藥材中各成分的含量影響較大。其中貴州貴定的百尾參藥材圖譜與共有模式圖譜比較相似度低于0.6，與其他產(chǎn)地冷水花藥材相比具有明顯的差異。

另外，從系統(tǒng)聚類分析和主成分分析2種化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對(duì)百尾參色譜積分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行模式識(shí)別結(jié)果顯示，兩者判斷結(jié)果基本一致，且與相似度分析結(jié)果類似。因此，將指紋圖譜及相似度分析和模式識(shí)別結(jié)合起來(lái)進(jìn)行中藥材質(zhì)量控制是一種行之有效的手段，有利于全面、準(zhǔn)確地控制中藥材質(zhì)量。

[1] 貴州省藥品監(jiān)督管理局.貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[M].貴陽(yáng)：貴州科技出版社，2003：162.

[2] CHEN L，SU Y F，YIN Z Y，et al.Flavonoids fromDisporumcantoniense(Liliaceae)[J].Biochem Syst Ecol，2009，37(5)：609-612.

[3] 陳磊.百合科兩種藥用植物化學(xué)成分及生物活性研究[D].天津：天津大學(xué)，2009：216-217.

[4] 甘秀海，周欣，梁志遠(yuǎn)，等.百尾參根的化學(xué)成分研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19(23)：140-142.

[5] 甘秀海，趙超，梁志遠(yuǎn)，等.百尾參止咳活性成分研究[J].中國(guó)中藥雜志，2013，38(23)：4099-4102.

[6] 周欣，陳華國(guó)，張明，等.刺梨高效液相色譜指紋圖譜研究[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2014，33(1)：82-85.

HPLC Fingerprint Analysis of Disporum Cantoniense

GAN Xiuhai1, LIANG Zhiyuan1, ZHOU Xin2, ZHAO Chao2, WEI Gang3

(1.SchoolofChemistryandLifeScience,GuizhouNormalCollege,Guiyang550018,China； 2.ResearchCenterforQualityControlofNaturalMedicine,GuizhouNormalUniversity,Guiyang550001,China； 3.CSIROMaterialsScienceandEngineering,NSW2070,Australia)

Objective To establish the HPLC fingerprint ofDisporumcantoniense. Methods HPLC analysis was performed on Agilent Zorbax SB-C18chromatographic column (250 mm×4.6 mm, 5 μm) with the mobile phase consisting of methanol-0.05% phosphoric acid in gradient mode.The flow rate was 1.0 mL·min-1, the detection wavelength was 256 nm and the column temperature was 30 ℃. Results The HPLC fingerprint of 15 batches ofDisporumcantoniensewas established.Thirteen common peaks in the fingerprint were demarcated, four of which were identified by reference substances.Chemical pattern recognition of fingerprint was performed by hierarchical cluster analysis and principal component analysis. Conclusion The method is simple, accurate and has a good repeatability, and can be used for quality control ofDisporumcantoniense.

Disporumcantoniense； Chromatography, high performance liquid； Fingerprint； Similarity； Hierarchical cluster analysis

2014-12-04

2015-01-16

*教育部春暉計(jì)劃項(xiàng)目(Z2011041)；貴州特色生物資源開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(2012009)

甘秀海(1976-)，男，湖南懷化人，副教授，碩士，研究方向：中藥化學(xué)及質(zhì)量控制。電話：0851-85816647，E-mail：gxh200719@163.com。

梁志遠(yuǎn)(1959-)，女，貴州貴陽(yáng)人，教授，學(xué)士，研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)。電話：0851-85816647，E-mail：gzwh24000@sina.com。

R282；R927.2

B

1004-0781(2015)12-1623-05

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.12.019