程靜，梅蕊，劉忠，劉萍，梅利平，宋紅萍

(1.華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬普愛醫(yī)院藥劑科，武漢 430033；2.武漢市精神衛(wèi)生中心精神科，武漢 430023)

復方硝酸甘油凝膠對大鼠皮膚潰瘍創(chuàng)面的調(diào)節(jié)作用

程靜1，梅蕊2，劉忠1，劉萍1，梅利平1，宋紅萍1

(1.華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬普愛醫(yī)院藥劑科，武漢 430033；2.武漢市精神衛(wèi)生中心精神科，武漢 430023)

目的研究復方硝酸甘油凝膠劑對大鼠皮膚潰瘍的保護作用及其機制。方法建立54只大鼠皮膚潰瘍模型，隨機分成3組，每組18只，即模型對照組、京萬紅組、復方硝酸甘油凝膠劑組，觀察創(chuàng)面大體情況及愈合時間，計數(shù)造模后第7天、第14天創(chuàng)面的成纖維細胞數(shù)、新生毛細血管數(shù)。采用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)法測定造模后第7天、第14天創(chuàng)面的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、血管生成素-1(Ang-1)、低氧誘導因子(HIF-1α) mRNA表達。結(jié)果與模型對照組比較[(24.17±5.91) d]，復方硝酸甘油凝膠劑能明顯縮短皮膚愈合時間[(14.67±3.76) d，P<0.01]。與模型對照組比較，復方硝酸甘油凝膠組增加造模后第7天創(chuàng)面中成纖維細胞[(61.20±7.56)個]和新生毛細血管數(shù)量[(9.35±1.43)個，P<0.05]；上調(diào)VEGF(1.692±0.196)、HIF-1α(1.527±0.174)、Ang1(1.548±0.203)mRNA表達(P<0.05或P<0.01)；降低造模后第14天創(chuàng)面中成纖維細胞(28.00±5.96)個和新生毛細血管數(shù)量[(4.20±1.30)個，(P<0.01)]；下調(diào)VEGF(1.156±0.123)、HIF-1α(1.021±0.105)、Ang1(1.034±0.134) mRNA表達(P<0.05)。結(jié)論復方硝酸甘油凝膠劑通過調(diào)節(jié)成纖維細胞、新生毛細血管數(shù)量和VEGF/Ang1/HIF-1α信號轉(zhuǎn)導通路達到治療皮膚潰瘍的作用。

硝酸甘油凝膠劑，復方；潰瘍，皮膚；成纖維細胞；新生毛細血管；信號轉(zhuǎn)導通路

皮膚潰瘍是臨床上的常見病之一，分為急性和慢性兩類，是由于多種原因?qū)е麦w表皮膚缺損或潰爛而形成創(chuàng)面的一種疾病。此病可發(fā)生在身體各處，多易久治不愈，常給患者造成比較大的痛苦。治療藥物主要有前列腺素、表皮細胞生長因子、堿性成纖維細胞生長因子等藥物，但是費用昂貴，療程很長，且療效不理想，尋找更有效治療藥物是一個重要的研究方向[1]。硝酸甘油臨床主要用于治療心腦血管疾病，如心絞痛、急性心肌梗死、慢性充血性心力衰竭等。近幾年，有研究報道將硝酸甘油軟膏局部用于治療肛裂，明顯促進傷口愈合[2]。筆者查閱國內(nèi)外文獻，未見硝酸甘油凝膠劑的報道。為此本研究以新生毛細血管及成纖維細胞是潰瘍創(chuàng)面肉芽的主要構成成分為對象，探討復方硝酸甘油凝膠劑治療皮膚潰瘍的作用及初步作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物 無特定病原體(specific-pathogen free,SPF)級，雄性斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?Sprague Dawley，SD)大鼠54只，體質(zhì)量220～250 g，由湖北省實驗動物研究中心提供，實驗動物合格證號：SCXK(鄂)2008-0005；使用許可證號：SYXK(鄂)2008-0014。動物自由進食飲水，12 h明暗交替光照，環(huán)境溫度22～24 ℃，相對濕度45%～75%。

1.2 藥品與試劑 復方硝酸甘油凝膠劑(實驗室自制，處方由硝酸甘油5%、醋酸氯己定0.3%等成分組成，批號：120708)；京萬紅(天津達仁堂達二藥業(yè)有限公司，批號：211509)。提取總RNA試劑盒(美國OMEGA公司，批號：R6834-01)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連Takar公司，批號：RR420A)；實時熒光定量試劑盒(大連Takara公司，批號：RR036Q)。

1.3 儀器 ABI 9700普通PCR儀(美國ABI公司)；ABI 7500實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)；EPPENDORF Flus核酸蛋白測定儀(德國Eppendorf公司)。

1.4 動物造模與分組 SD大鼠進行皮膚潰瘍造模，實驗前背部皮膚靠近頭部剪毛后涂抹8%硫化鈉脫毛，脫毛面積為3.5 cm×3.5 cm。用7%水合氯醛21 g·kg-1腹腔內(nèi)麻醉，俯臥固定于木板上，聚維酮碘消毒，將直徑為2 cm的圓形圖章在背部正中印出標記，剪去全層皮膚及皮下結(jié)締組織，深至筋膜，用50%冰醋酸涂創(chuàng)面，1次·d-1，共1周。將造模后大鼠按體質(zhì)量隨機分為3組，每組18只。動物皮膚給藥按照每平方厘米計算分別為復方硝酸甘油凝膠劑組(0.98 g·kg-1)、京萬紅組(京萬紅0.79 g·kg-1)、模型對照組(等量基質(zhì))。各組于造模次日開始換藥，將藥膏直接涂布于創(chuàng)面上，京萬紅組涂布京萬紅，模型對照組涂布基質(zhì)。3組換藥后均在創(chuàng)面上加蓋一層薄膜，用醫(yī)用膠帶固定，換藥至創(chuàng)面愈合。3組分別在造模后第7天、第14天每組各處死大鼠6只，取創(chuàng)面中心肉芽組織蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色。剩下大鼠繼續(xù)給藥[3]。

1.5 標本采集及指標觀察 ①創(chuàng)面大體情況觀察：每日換藥時觀察創(chuàng)面愈合情況如創(chuàng)面水腫滲出程度、是否干燥、有無分泌物、創(chuàng)面紅腫變化等。②記錄各組創(chuàng)面完全愈合所需時間：以創(chuàng)面完全上皮化作為判斷愈合依據(jù)。③組織學檢查：造模后第7天、第14天取各組動物創(chuàng)面組織進行常規(guī)HE染色，由病理醫(yī)師采用光鏡進行每個標本隨機觀察視野5個(每張切片取長方形四角及中心點視野5個)，應用Mias圖像分析系統(tǒng)3.0確保每個視野面積相等均為一幀圖像大小，圖像放大倍數(shù)為400倍，每個視野面積中避開毛細血管光鏡下觀察并計數(shù)肉芽組織中成纖維細胞數(shù)，取5個視野的平均值作為其計數(shù)。每個標本隨機觀察3個視野，同法計數(shù)新生毛細血管數(shù)，取3個視野的平均值作為其計數(shù)。④取造模后第7天、第14天的3組動物創(chuàng)面100 mg加入1 mL Trizol進行裂解，采用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)測定血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、血管生成素-1(angiopoietin-1，Ang-1)、低氧誘導因子(hypoxia inducible factor-1-alpha，HIF-1α)mRNA表達。VEGF上游引物：5′GGTGAGAGGTCTAGTTCCCC3′，下游引物：5′CCATGAACTTTCTGCTCTTC3′。Ang1上游引物：5′TAAATCAAACATCCC3′，下游引物：5′AGGTGTC-CAGCTCTTCCT3′。HIF-1α上游引物：5′ACGTGT-TATCTGTCGCTTTG3′，下游引物：5′TAGGTTTCT-GCTGCCTTGTAT3′。內(nèi)參選擇β-actin。

2 結(jié)果

2.1 觀察創(chuàng)面結(jié)果 復方硝酸甘油凝膠劑組創(chuàng)面濕潤潔凈，創(chuàng)面周邊及基底部可見鮮紅的肉芽組織，有少量炎性分泌物，淡黃色，稀薄，可見淡紅色新生上皮由四周向創(chuàng)面中心生長。用藥15 d后，大部分創(chuàng)面已愈合，留下一道瘢痕，可見毛發(fā)覆蓋。京萬紅組：創(chuàng)面干燥結(jié)痂，暗紅色，創(chuàng)面周圍新生上皮向中心生長，生長較快。模型對照組：有大量炎性分泌物，創(chuàng)面干燥結(jié)痂，將其痂取下，發(fā)現(xiàn)創(chuàng)面皮膚下均有小空洞，有部分皮膚發(fā)白發(fā)灰，僅見少量新生上皮生長，而且愈合慢。傷口較復方硝酸甘油凝膠劑用藥組恢復慢，同期情況下傷口面積較其他兩組大。

2.2 創(chuàng)面愈合時間 模型對照組平均愈合時間為(24.17±5.91) d，復方硝酸甘油組平均愈合時間為(14.67±3.76) d，京萬紅組平均愈合時間為(18.97±2.58) d。與模型對照組比較，復方硝酸甘油凝膠劑創(chuàng)面完全愈合所需時間明顯縮短(t=3.322，P<0.01)，具有促進體表皮膚愈合的作用。

2.3 對創(chuàng)面成纖維細胞、新生毛細血管的影響 與模型對照組比較，京萬紅組第7天成纖維細胞數(shù)量明顯增加(t=2.427，P<0.05)復方硝酸甘油凝膠劑組給藥后第7天成纖維細胞、新生毛細血管數(shù)量明顯增加(t=2.390，t=2.237，P<0.05)。見圖1。與模型對照組比較，京萬紅組和復方硝酸甘油凝膠劑組給藥后第14天成纖維細胞、新生毛細血管數(shù)量均明顯減少(t=3.002，t=3.117，P<0.01)。見表1。表明復方硝酸甘油凝膠劑對潰瘍創(chuàng)面修復過程肉芽組織中成纖維細胞、新生毛細血管數(shù)量具有良好的調(diào)節(jié)作用。

A.模型對照組；B.京萬紅組；C.復方硝酸甘油凝膠劑組

表1 3組大鼠創(chuàng)面成纖維細胞、新生毛細血管數(shù)量的比較

Tab.1 Comparison of the numbers of fibroblasts and new blood capillaries in skin ulcer wound among three groups of rats

個

與模型對照組同時間點比較，*1P<0.05，*2P<0.01

Compared with model control group at same time point，*1P<0.05，*2P<0.01

2.4 對創(chuàng)面VEGF、HIF-1α、Ang1 mRNA表達的影響 與模型對照組比較，復方硝酸甘油凝膠劑組給藥后第7天的VEGF、HIF-1α、Ang1 mRNA表達明顯增加(t=2.331，t=2.927，t=2.666，P<0.05或P<0.01)。與模型對照組比較，復方硝酸甘油凝膠劑組給藥后第14天的VEGF、HIF-1α、Ang1 mRNA表達明顯減少(t=2.253，t=2.368，t=2.325，P<0.05)。表明復方硝酸甘油凝膠劑對潰瘍創(chuàng)面修復過程肉芽組織中VEGF、HIF-1α、Ang1 mRNA表達具有良好的調(diào)節(jié)作用。見表2。

3 討論

表2 3組大鼠創(chuàng)面VEGF、HIF-1α、Ang1 mRNA表達的比較

Tab.2 Comparison of the mRNA expression of VEGF, HIF-1α and Ang1 mRNA among three groups of rats

組別與時間VEGFHIF?1αAng1模型對照組 第7天1．418±0．2111．254±0．1481．293±0．117 第14天1．324±0．1351．202±0．1551．244±0．176京萬紅組 第7天1．639±0．136?11．436±0．133?11．461±0．141?1 第14天1．222±0．1241．103±0．1481．214±0．196復方硝酸甘油凝膠劑組 第7天1．692±0．196?11．527±0．174?21．548±0．203?2 第14天1．156±0．123?11．021±0．105?11．034±0．134?1

與模型對照組同時間點比較，*1P<0.05，*2P<0.01

Compared with model control group at same time point，*1P<0.05，*2P<0.01

由于凝膠具有良好的生物相容性，對藥物釋放具有緩釋和控釋作用，形狀美觀，易于涂布使用，局部給藥后易吸收，不污染衣物，穩(wěn)定性較好，近年來成為局部外用制劑的研發(fā)熱點[4]。2010年一項Meta分析顯示，與安慰藥組比較，連續(xù)3周給予硝酸甘油軟膏明顯促進傷口愈合(P<0.01)，可能是硝酸甘油增加黏膜下血液流動，舒張血管改善潰瘍的缺血狀態(tài)，同時緩解疼痛[5]。醋酸氯己定為消毒防腐劑，能夠殺滅創(chuàng)面感染的細菌，具有抗炎作用。筆者在本實驗中研究將硝酸甘油與醋酸氯己定制成凝膠劑，在皮膚表面形成透明的薄膜，能保證創(chuàng)面濕潤、能較長時間與創(chuàng)面緊密粘附，滲透性好，易于吸收，避免換藥時對創(chuàng)面新生組織的損傷。

VEGF是血管新生的主要調(diào)控因子，作用最強的促血管內(nèi)皮細胞生成的調(diào)控因子，刺激血管內(nèi)皮細胞分裂增殖從而增加微血管新生，又可提高血管通透性，從而促進創(chuàng)面的生長愈合。ANN等[6]在研究中發(fā)現(xiàn)新生毛細血管能改善創(chuàng)面微循環(huán)，同時帶走不利于創(chuàng)面的代謝產(chǎn)物及毒物。有研究顯示如果創(chuàng)面中VEGF可保持持續(xù)性分泌狀態(tài)，對加速創(chuàng)面愈合具有重要意義[7]。Ang1能通過旁分泌途徑誘導內(nèi)皮細胞遷移，被證明與血管新生密切相關。Ang1可刺激血管滲透率增加，或通過內(nèi)皮細胞釋放TGF-β和血小板衍生生長因子B增加，作用于FGF-4激活VEGF表達，從而促進血管生成[8]。HIF-1α作為必需的多樣血管生成因子在創(chuàng)面愈合中有非常重要的作用。研究表明由于HIF-1將各種血管形成因子作為靶基因，如VEGF、PLGF、Ang等，使用HIF-1α基因治療后，創(chuàng)面愈合速度明顯加快，血管新生數(shù)量也明顯增多[9]。因此，VEGF/ Ang1/HIF-1α信號轉(zhuǎn)導通路具有促進創(chuàng)面愈合血管化的作用。

本研究結(jié)果顯示，復方硝酸甘油凝膠劑組給藥后第7天與血管新生相關的VEGF、HIF-1α、Ang1基因表達均較模型對照組增加，且3個基因表達水平高于京萬紅組，而第14天的3個基因表達水平均較模型對照組降低，而京萬紅組第14天對3個基因表達無影響，同時同一組3個基因表達水平第14天較第7天降低，呈現(xiàn)先促進后抑制的作用方式。與病理學檢查相一致：給藥后第7天復方硝酸甘油凝膠劑組新生毛細血管數(shù)目較模型對照組增加，且同一組第14天較第7天毛細血管數(shù)目減少。同時也與創(chuàng)面愈合分期一致。炎癥期：一般從創(chuàng)傷即刻開始維持3～5 d，以凝血及炎癥為特點；增殖期：又稱修復期，一般為傷后4～14 d，包括上皮形成、新生毛細血管形成、肉芽組織形成3個過程；重塑期：指傷后8 d～1年。主要包括膠原纖維強度增高，降解多余的膠原纖維，過剩的毛細血管網(wǎng)消退等[10-11]。

綜上所述，復方硝酸甘油凝膠劑能明顯縮短潰瘍創(chuàng)面愈合時間，促進創(chuàng)面愈合，其機制可能通過調(diào)節(jié)VEGF/Ang1/HIF-1α信號轉(zhuǎn)導通路，早期前7 d通過上調(diào)VEGF、HIF-1α、Ang1 mRNA表達，增加新生毛細血管數(shù)量，改善潰瘍創(chuàng)面微循環(huán)；同時增加成纖維細胞數(shù)量，促進潰瘍創(chuàng)面肉芽組織的形成。14 d后通過下調(diào)VEGF、HIF-1α、Ang1 mRNA表達，降低新生毛細血管數(shù)和成纖維細胞數(shù)量，利于創(chuàng)面重塑修復。

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Effect of Compound Nitroglycerin Gel on Skin Ulcer Wound in Rats

CHENG Jing1, MEI Rui2, LIU Zhong1, LIU Ping1，MEI Liping1, SONG Hongping1

(1.DepartmentofPharmacy,PuaiHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430033,China； 2.DepartmentofPsychiatry,WuhanMentalHealthCenter,Wuhan430023,China)

Objective To study the protective effect of compound nitroglycerin gel on rats with skin ulcer wound and its action mechanism. Methods Skin ulcer modle of 54 rats was established.Then the rats were randomly divided into three groups (n=18 each), including model control group,Jinwanhonggroup, and compound nitroglycerin gel group.Wound healing process and healing time were recorded.At the day 7 and 14 after the model was established, the number of fibroblasts and new blood capillaries of granulation tissue from center of the wound were measured,and RT-PCR was used to detect mRNA expression levels of VEGF, Ang1 andHIF-1α. Results As compared with model control group [(24.17±5.91) days], healing time of skin in the compound nitroglycerin gel group was significantly shorter [(14.67±3.76) days,P<0.01].The numbers of fibroblasts (61.20±7.56) and new blood capillaries (9.35±1.43) were increased, and mRNA expression levels of VEGF (1.692±0.196), HIF-1α (1.527±0.174) and Ang1 (1.548±0.203) were remarkably up-regulated on 7thday (P<0.05 orP<0.01).While on 14thday, the numbers of fibroblasts (28.00±5.96) and new blood capillaries (4.20±1.30) were decreased and the mRNA expression levels of VEGF (1.156±0.123), HIF-1α (1.021±0.105) and Ang1 (1.034±0.134) were significantly down-regulated (P<0.05 orP<0.01). Conclusion Compound nitroglycerin gel can treat skin ulcer wound via regulating the numbers of fibroblasts, new blood capillaries and VEGF/Ang1/HIF-1α signal transduction pathway.

Nitroglycerin gel, compound；Ulcer, skin； Fibroblast； New blood capillary； Signal transduction pathway

2014-09-24

2014-12-04

程靜(1983-)，女，湖北武漢人，主管藥師，碩士，研究方向：藥理學。電話：027-68834860，E-mail：chengjing-429521@163.com。

宋紅萍(1968-)，女，湖北隨州人，主任藥師，碩士，研究方向：藥劑學。電話：027-68835024，E-mail：Songhongping@126.com。

R965；R751

A

1004-0781(2015)12-1591-04

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.12.011