肖清萍，劉建文，張閩紅，李富歡，郭東

(江西省吉安市中心人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，吉安 343000)

二苯并吖庚因注射液對(duì)大鼠肺動(dòng)脈高壓的影響

肖清萍，劉建文，張閩紅，李富歡，郭東

(江西省吉安市中心人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，吉安 343000)

目的探討二苯并吖庚因(DBZ)對(duì)大鼠肺動(dòng)脈高壓的影響。方法將30只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組和DBZ組，每組10只。正常對(duì)照組：腹腔注射0.9%氯化鈉溶液；模型對(duì)照組：建立大鼠肺動(dòng)脈高壓模型，腹腔注射0.9%氯化鈉溶液5 mg·kg-1；DBZ組：建立大鼠肺動(dòng)脈高壓模型，靜脈注射DBZ 1 mg·mL-1·d-1。超聲心動(dòng)圖檢測右心室壓力，利用蘇木精-伊紅染色觀察肺動(dòng)脈的重塑，并利用Western Blot法檢測肺組織增殖細(xì)胞核抗原的表達(dá)，CCK-8法檢測肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖。結(jié)果與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠右心室壓力增高[(4.60±0.16) kPa比(3.37±0.18) kPa]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而且肺動(dòng)脈重塑及肺動(dòng)脈平滑肌增殖均明顯增加。與模型對(duì)照組比較，DBZ組大鼠肺組織中右心室壓力降低，肺動(dòng)脈重塑以及肺動(dòng)脈平滑肌增殖均顯著降低。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與模型對(duì)照組平滑肌細(xì)胞比較，低氧誘導(dǎo)后DBZ處理組平滑肌細(xì)胞的增殖顯著降低[(2.073±0.064)比(4.392±0.013)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論Notch信號(hào)通路參與肺動(dòng)脈高壓病理過程，DBZ通過抑制Notch信號(hào)通路減少平滑肌細(xì)胞增殖，對(duì)肺動(dòng)脈高壓大鼠有保護(hù)作用。

二苯并吖庚因；Notch信號(hào)通路；平滑肌細(xì)胞，肺動(dòng)脈；增殖，細(xì)胞；肺動(dòng)脈高壓

肺動(dòng)脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)是一種以肺血管阻力持續(xù)升高為特征的高致死率臨床綜合征[1]。目前研究提示肺動(dòng)脈中層平滑肌細(xì)胞增生在肺動(dòng)脈高壓發(fā)病機(jī)制中起著重要作用[2]。研究證實(shí)，肺動(dòng)脈高壓時(shí)，參與肺血管重塑的內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等存在不同程度的Notch家族基因表達(dá)上調(diào)[3]。研究表明Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在肺血管形成，血管平滑肌細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞等增殖、分化、凋亡方面起重要調(diào)控作用，參與PAH的發(fā)生和發(fā)展[4]。二苯并吖庚因(dibenzazepines，DBZ)為抑制Notch信號(hào)通路的常用藥物。本研究采用大鼠低氧誘導(dǎo)肺動(dòng)脈高壓模型，并利用DBZ干預(yù)治療，觀察探討DBZ對(duì)低氧所致大鼠肺動(dòng)脈高壓的影響及機(jī)制，為臨床治療肺動(dòng)脈高壓奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 雄性SPF級(jí)SD大鼠30只，體質(zhì)量200～300 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0001，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào) ：SYXK(京)2012-0024。普通飼養(yǎng)飼料，自由飲水。

1.2 試劑與儀器 DBZ(美國Sigma公司，批號(hào)：SML0649)；蛋白提取試劑盒(美國Thermo公司，批號(hào)：78503)；增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)抗體(美國Santa Cruz公司，批號(hào)：SC-25280)；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydro-genase,GAPDH)抗體(美國Santa Cruz抗體，批號(hào)：SC-365062)；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(Cell Counting Kit-8)(日本同仁化學(xué)公司，批號(hào)：CK04)；達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbacco's modified Eagle's medium，DMEM，美國Hyclone公司，批號(hào)：SH30022.01B)；胎牛血清(美國Hyclone公司，批號(hào)：SH30396.03)；小動(dòng)物超聲儀(Vevo770 ultrasound system，加拿大Visual Sonics公司)。

1.3 動(dòng)物分組與模型制備 按照隨機(jī)數(shù)字表法分為3組，每組10只：正常對(duì)照組(腹腔注射0.9%氯化鈉溶液)、模型對(duì)照組(低氧處理及腹腔注射0.9%氯化鈉溶液)、DBZ組(低氧處理及靜脈注射DBZ)。模型對(duì)照組及DBZ組SD大鼠置于常壓低氧艙，低氧艙充入氮?dú)馐寡鯘舛葹?10.0±0.5)%，每天8 h，每周6 d，共4周；正常對(duì)照組及模型對(duì)照組腹腔注射0.9%氯化鈉溶液5 mg·kg-1，DBZ組腹腔注射 DBZ(1 mg·mL-1·d-1)。

1.4 蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色觀察肺動(dòng)脈形態(tài) 10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈放血處死。分離取出肺，放入0.9%氯化鈉溶液漂洗去除血污；用10%甲醛固定組織，脫水，石蠟包埋，切成厚4 μm切片，進(jìn)行HE染色，觀察肺動(dòng)脈血管壁的形態(tài)。

1.5 Western blot檢測肺組織PCNA表達(dá) 提取大鼠肺組織總蛋白，并測定蛋白濃度。取蛋白80 μg，10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamid gel electrophoresis,SDS-PAGE)后，用半干轉(zhuǎn)電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉37 ℃封閉1 h后，分別加入一抗，4 ℃過夜，洗膜后，分別加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠和抗兔IgG(1：1 000稀釋)，37 ℃孵育1 h；洗膜后，利用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(enhanced chemiluminescence，ECL)自顯影，以GAPDH的表達(dá)作為上樣參照，目的條帶的灰度值與內(nèi)參條帶的灰度值相比較。

1.6 肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞提取 10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈放血處死。分離取出肺組織，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution,PBS)溶液漂洗3次，用眼科鑷去除肺組織，分離出肺動(dòng)脈，去除纖維外膜，用眼科剪剖開動(dòng)脈，將組織剪成組織塊1 mm×1 mm，放于15 cm×15 cm培養(yǎng)皿底部，加入含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液2 mL，使培養(yǎng)液掠過組織塊，翻轉(zhuǎn)靜置37 ℃、5%二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱中3 h，再次翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿使組織塊浸于培養(yǎng)液中，靜置培養(yǎng)。

1.7 CCK-8檢測平滑肌細(xì)胞的增殖 將平滑肌細(xì)胞以5×104個(gè)·mL-1接種于96孔培養(yǎng)板中，將細(xì)胞分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組和低氧誘導(dǎo)后加入DBZ處理組(DBZ組)，每組設(shè)復(fù)孔3個(gè)，每孔100 μL培養(yǎng)體系。正常對(duì)照組在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h；模型對(duì)照組和DBZ組利用混合氣(N294%、CO25%、O21%)置換法低氧分別處理24 h；然后每孔分別加入10 μL的CCK-8試劑，培養(yǎng)箱中孵育3 h，酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞的A450值。

2 結(jié)果

2.1 超聲心動(dòng)圖測右心室壓力 低氧飼養(yǎng)大鼠4周后，模型對(duì)照組及DBZ組右室壓力較正常對(duì)照組明顯增加，表明造模成功(P<0.01)；DBZ組右室壓力較模型對(duì)照組顯著下降，表明抑制DBZ可以改善低氧誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓(P<0.01)。見表1。

表1 3組大鼠右心室壓力檢測結(jié)果的比較

Tab.1 Comparison of right ventricular pressure among three groups of rats

組別右心室壓力/kPa正常對(duì)照組3．37±0．18模型對(duì)照組4．60±0．16?1DBZ組3．75±0．14?2

與正常對(duì)照組比較，t=2.781，*1P<0.01； 與模型對(duì)照組比較，t=7.235，*2P<0.01

Compared with normal control group，t=2.781，*1P<0.01；compared with model control group，t=7.235，*2P<0.01

2.2 HE染色結(jié)果 常規(guī)顯微鏡顯示模型對(duì)照組肺動(dòng)脈血管壁較正常對(duì)照組明顯增厚，提示造模成功；DBZ組肺動(dòng)脈血管壁厚度較模型對(duì)照組明顯減輕，表明DBZ可顯著改善低氧誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓。見圖1。

2.3 PCNA蛋白表達(dá) 模型對(duì)照組肺組織PCNA蛋白表達(dá)量較正常對(duì)照組明顯增加，提示肺動(dòng)脈高壓中平滑肌細(xì)胞增殖增加；DBZ組肺組織PCNA表達(dá)量較模型對(duì)照組顯著降低，表明DBZ可改善肺動(dòng)脈高壓平滑肌細(xì)胞的增殖。見圖2。

A.正常對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.DBZ組

A.正常對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.DBZ組

圖2 3組大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞PCNA蛋白的表達(dá)情況

A.normal control group；B.model control group；C.DBZ group

Fig.2 Expression of PCNA protein in smooth muscle cells of pulmonary artery in three groups of rats

2.4 3組平滑肌細(xì)胞增殖情況比較 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示DBZ組平滑肌細(xì)胞在450 nm處的A值較正常對(duì)照組明顯下降，提示DBZ組平滑肌細(xì)胞的增殖較正常對(duì)照組顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 3組大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖率比較

Tab.2 Comparison of proliferation rate of smooth muscles cells in pulmonary artery among three groups of rats

組別A450正常對(duì)照組1．240±0．055模型對(duì)照組4．392±0．013?1DBZ組2．073±0．064?2

與正常對(duì)照組比較，t=9.643，*1P<0.01； 與模型對(duì)照組比較，t=8.150，*2P<0.01

Compared with normal control group，t=9.643，*1P<0.01；compared with model control group，t=8.150，*2P<0.05

3 討論

PAH的產(chǎn)生是由不同病因和發(fā)病機(jī)制引起肺血管阻力持續(xù)性增加。持續(xù)升高的肺血管阻力可引起右心室壓力負(fù)荷增加，最終導(dǎo)致右心功能障礙[5]。PAH特征性的病理改變?yōu)榉蝿?dòng)脈中膜平滑肌細(xì)胞增殖導(dǎo)致小動(dòng)脈管壁增厚和細(xì)動(dòng)脈肌化[6]。研究證實(shí)，右心室壓力的增高間接反映肺動(dòng)脈高壓的嚴(yán)重程度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示大鼠進(jìn)行缺氧處理4周后，模型對(duì)照組大鼠右心室壓力較正常對(duì)照組顯著增高，表明缺氧處理使大鼠肺動(dòng)脈壓力增高。用DBZ腹腔注射后右心室壓力降低，肺動(dòng)脈血管重塑改善，提示DBZ對(duì)缺氧誘導(dǎo)的PAH大鼠有一定保護(hù)作用。其作用機(jī)制為通過抑制Notch信號(hào)通路進(jìn)而抑制肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖。

本實(shí)驗(yàn)顯示大鼠缺氧后右心室壓力增高，肺動(dòng)脈血管重塑增加。缺氧處理肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞后，平滑肌細(xì)胞增殖增加。已發(fā)現(xiàn)Notch信號(hào)通路在PAH中激活，表明了Notch信號(hào)通路參與了PAH損傷機(jī)制[7]。經(jīng)DBZ腹腔注射后，肺組織中Notch信號(hào)通路受抑制，缺氧后右心室壓力降低，肺動(dòng)脈血管重塑減少。DBZ體外處理缺氧的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞增殖顯著降低，提示DBZ可能通過抑制平滑肌細(xì)胞增殖減輕肺動(dòng)脈重塑，緩解肺動(dòng)脈及右心室壓力的增高。綜上所述，在缺氧誘導(dǎo)大鼠PAH模型中，DBZ通過抑制肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖進(jìn)而抑制PAH血管重塑過程，研究結(jié)果為有效預(yù)防肺動(dòng)脈高壓提供了有力的基礎(chǔ)。

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Effect of Dibenzazepines Injection on Pulmonary Hypertension in Rats

XIAO Qingping, LIU Jianwen, ZHANG Minhong, LI Fuhuan, GUO Dong

(DepartmentofRespiratoryMedicine，Ji'anCentralPeople'sHospitalofJiangxiProvince,Ji'an343000,China)

Objective To investigate the effect and mechanism of dibenzazepines (DBZ) injection on pulmonary hypertension in rat. Methods Rat models of pulmonary hypertension were established, and 30 male rats were randomly divided into 3 groups： normal control group with saline injection, pulmonary hypertension model control group with hypoxia treatment and saline injection, DBZ group with hypoxia treatment and DBZ injection.The right ventricular pressure was determined by ultrasound cardiogram.Pulmonary arterial remodeling was detected by HE staining.Proliferation cell nuclear antigen and CCK-8 in pulmonary arterial smooth muscle cells were detected by Western blotting. Results The right ventricular pressure of pulmonary hypertension group was significantly increased compared with normal control group [(4.60±0.16) kPavs.(3.37±0.18) kPa(P<0.01)].After hypoxia treatment, pulmonary arterial remodeling and proliferation of pulmonary arterial smooth muscle cells of the rats of pulmonary hypertension group were augmented remarkably.Rats from DBZ group showed reductions in right ventricular pressure, amelioration in pulmonary arterial remodeling and suppression in proliferation of pulmonary arterial smooth muscle cells.The proliferation of rat pulmonary artery smooth muscle cells decreased significantly in DBZ treated group [(2.073±0.064)vs.(4.392±0.013)] compared with model control group (P<0.05). Conclusion Notch pathway takes part in the process of pulmonary hypertension, and DBZ injection can significantly suppress the proliferation of pulmonary artery smooth muscle cells with a protective effect on pulmonary hypertension.

Dibenzazepines；Notch pathway；Smooth muscle cells,pulmonary arterial； Proliferation, cell；Pulmonary arterial hypertension

2014-03-03

2014-05-31

肖清萍(1981-)，女，江西新干人，主治醫(yī)師，碩士，從事呼吸內(nèi)科臨床工作。電話：(0)15811549627，E-mail：xiaoqingping12356@126.com。

郭東(1968-)，男，江西吉安人，主任醫(yī)師，學(xué)士，研究方向：內(nèi)科學(xué)。電話：(0)15811549431，E-mail：tgzy820505@163.com。

R972.4； R543.2

A

1004-0781(2015)12-1576-04

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.12.007