龍向淑，吳強(qiáng)，劉太河，宋方，黃晶，田茂波，肖燕

(1.貴州省人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，貴陽(yáng) 550002；2.安順學(xué)院數(shù)學(xué)與計(jì)算機(jī)科學(xué)學(xué)院，安順 561000)

·藥物研究·

干擾素α通過(guò)P204和RAS信號(hào)途徑誘導(dǎo)大鼠血管平滑肌細(xì)胞凋亡*

龍向淑1，吳強(qiáng)1，劉太河2，宋方1，黃晶1，田茂波1，肖燕1

(1.貴州省人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，貴陽(yáng) 550002；2.安順學(xué)院數(shù)學(xué)與計(jì)算機(jī)科學(xué)學(xué)院，安順 561000)

目的觀察干擾素-α(IFN-α)對(duì)大鼠血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)凋亡的影響，并探討其部分機(jī)制。方法將VSMCs分為A、B、C 3組，A組轉(zhuǎn)染非特異性siRNA，B組予IFN-α干預(yù)后轉(zhuǎn)染非特異性siRNA，C組予IFN-α干預(yù)后轉(zhuǎn)染IFN誘導(dǎo)蛋白204基因(IFI204) siRNA，均培養(yǎng)至48 h收集細(xì)胞。反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測(cè)IFN誘導(dǎo)蛋白204(P204) mRNA表達(dá)，Western blot檢測(cè)P204、RAS蛋白表達(dá)及RAF/ERK磷酸化變化，流式細(xì)胞儀Annexin-V FITC/PI法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。結(jié)果與A組比較，B組P204 mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，細(xì)胞凋亡增多(P<0.05)，伴RAS蛋白表達(dá)減少(P<0.05)，RAF/ERK磷酸化水平下降(P<0.05)；C組P204 mRNA及蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，細(xì)胞凋亡減少(P<0.05)，RAS蛋白表達(dá)增多和RAF/ERK磷酸化水平上調(diào)(P<0.05)。結(jié)論P(yáng)204及RAS信號(hào)途徑參與IFN-α誘導(dǎo)大鼠VSMCs凋亡過(guò)程的調(diào)控。

干擾素；血管平滑肌細(xì)胞；干擾素誘導(dǎo)蛋白204；RAS信號(hào)途徑；凋亡

血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)是構(gòu)成血管壁的主要實(shí)質(zhì)細(xì)胞，各種理化刺激導(dǎo)致VSMCs過(guò)度增殖及凋亡減少是動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)、高血壓(hypertension，HP)及經(jīng)皮血管成形術(shù)(percutaneous transluminal angioplasty，PTA)后再狹窄等血管增殖性疾病(vascular proliferative diseases，VPD)發(fā)病的主要機(jī)制[1]。干擾素(interferon，IFN)是一組具有抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抑制細(xì)胞增殖及促進(jìn)細(xì)胞凋亡等作用的活性細(xì)胞因子家族[2-8]。IFN誘導(dǎo)蛋白204(interferon induction protein 204，P204)是IFN誘導(dǎo)P200家族的鼠類蛋白成員。研究顯示，IFN-α可誘導(dǎo)P204表達(dá)而抑制大鼠VSMCs及血管外膜成纖維細(xì)胞增殖[9-10]，但I(xiàn)FN對(duì)VSMCs凋亡的影響及其機(jī)制尚未完全明確。筆者在本研究中用IFN-α和(或)P204 siRNA處理大鼠原代VSMCs，觀察VSMCs凋亡變化并探討其部分機(jī)制，為IFN在VPD領(lǐng)域的應(yīng)用提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?Sprague Dawley,SD)大鼠(雄性2只，雌性1只)，約5周齡，體質(zhì)量120～140 g，第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(渝)2012-0003。

1.2 試劑 IFN-α(批號(hào)：19990034)，購(gòu)自北京三元基因工程有限公司；α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)單克隆抗體(批號(hào)：BM0002)、免疫組化染色試劑盒(批號(hào)：SA1021)及二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色試劑盒(批號(hào)：AR1022)購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：C1063)和Tubulin抗體(批號(hào)：AT819)購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；TRNzol 總RNA提取試劑(批號(hào)：DP405)、2×Taq PCR MasterMix(批號(hào)：KT201)和100 bp DNA Ladder(批號(hào)：MD109)購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)試劑盒(批號(hào)：DRR047A)購(gòu)自TaKaRa公司；聚合酶鏈反應(yīng)polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增引物由寶生物工程(大連)有限公司合成，具體序列如下，P204，上游：5′-TCATGGTCCC-AAACAAGTGA-3′，下游：5′-ACCCATTGCACCCAA-AATAA-3′(擴(kuò)增長(zhǎng)度200 bp)；GAPDH，上游：5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，下游：5′-TCCACCA-CCCTGTTGCTGTA-3′(擴(kuò)增長(zhǎng)度452 bp)；P204抗體(批號(hào)：sc-13367)及IFI204 siRNA(批號(hào)：sc-40700)購(gòu)自Santa Cruz公司；RAS(批號(hào)：ab108602)、p-RAF(批號(hào)：ab78334)及p-ERK 44/42抗體(批號(hào)：ab47339)購(gòu)自Abcam公司。

1.3 主要儀器 sw-cj-1f型超凈工作臺(tái)(吳江市金家壩金太凈化設(shè)備廠)；MCO-20AIC二氧化碳培養(yǎng)箱(日本SANYO Electric 公司)；5810R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；Veriti96孔型梯度PCR儀(美國(guó)ABI公司)；DU 640型核酸蛋白分析儀(美國(guó)Backman公司)；FACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)；DYY-7C型電泳儀(北京市六一儀器廠)；EC3 600型凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)UVP公司)。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組 按文獻(xiàn)[11]的方法培養(yǎng)VSMCs。取4～6代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。將VSMCs分為A、B、C 3組，A組未加IFN-α，與B組及C組同步轉(zhuǎn)染非特異性siRNA，B組予IFN-α干預(yù)后6 h轉(zhuǎn)染非特異性siRNA，C組予IFN-α干預(yù)后6 h轉(zhuǎn)染IFI204 siRNA，IFN終濃度為2×106U·L-1，3組干預(yù)后均培養(yǎng)至48 h收集細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 RT-PCR檢測(cè)mRNA表達(dá) 按Trizol 法提 取細(xì)胞總RNA，取總RNA1 μg 按RT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，取cDNA產(chǎn)物3 μL進(jìn)行PCR循環(huán)，PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃30 s、58 ℃30 s及72 ℃1 min，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。取PCR產(chǎn)物5 μL在2%瓊脂糖凝膠中電泳分析，電泳結(jié)果采用EC3 600型凝膠成像系統(tǒng)掃描成像。

1.6 Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá) 收集干預(yù)后的VSMCs于離心管(eppendorf，EP)中，1 000 r·min-1(半徑=250 mm)離心5 min、去上清液后加入細(xì)胞裂解液，4 ℃冷凍，離心5 min，取上清液另置于預(yù)冷、無(wú)菌的EP管中，BCA法蛋白定量。取蛋白樣品量80 μg于0.2 mL EP管中，加入十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)蛋白上樣緩沖液，100 ℃煮沸3 min。用8%SDS-PAGE恒壓80～100 V分離蛋白，4 ℃恒流250 mA×90 min轉(zhuǎn)移蛋白至聚偏氟乙烯(poly-vinylidene fluoride，PVDF)膜上。封閉液封閉PVDF膜2 h，去除封閉液，加入按1：500稀釋的一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，聚山梨酯20/TBS溶液(tris-buffered saline and tween 20，TBST)漂洗，加入按1：5 000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育2 h，TBST漂洗。將PVDF蛋白面朝上置于保鮮膜上，取增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法化學(xué)發(fā)光試劑A和B按1：1避光混合1 min，將混合液滴加至PVDF膜上，約1 min后去盡殘液，固定PVDF膜。X線膠片曝光、顯影及定影后掃描，用圖像軟件根據(jù)信號(hào)強(qiáng)弱對(duì)條帶進(jìn)行灰度分析。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 按Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒C1063說(shuō)明書(shū)操作收集細(xì)胞并染色，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

2 結(jié)果

2.1 干預(yù)因素對(duì)P204 mRNA和蛋白表達(dá)的影響 與A組比較，B組P204 mRNA和蛋白表達(dá)增加(P<0.05)，C組P204 mRNA和蛋白表達(dá)減少(P<0.05)；與B組比較，C組P204 mRNA和蛋白表達(dá)減少(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

Ⅰ.電泳圖；Ⅱ.柱形圖；與A組比較，*1P<0.05；與B組比較，*2P<0.05

圖1 3組大鼠VSMCs P204 mRNA及蛋白表達(dá)的比較(n=3)

Ⅰ.electrophotogram；Ⅱ.histogram；compared with group A，*1P<0.05；compared with group B，*2P<0.05

Fig.1 Comparison of VSMCs P204 mRNA and protein expression of among three groups of rats(n=3)

2.2 干預(yù)因素對(duì)VSMCs凋亡的影響 與A組比較，B組細(xì)胞凋亡增多(P<0.05)，C組細(xì)胞凋亡減少(P<0.05)；與B組比較，C組細(xì)胞凋亡減少(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

2.3 干預(yù)因素對(duì)RAS蛋白表達(dá)和RAF及ERK磷酸化p-RAF及p-ERK水平的影響 與A組比較，B組RAS 蛋白表達(dá)減少，RAF及細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extra-cellular signal-regulated kinase，ERK)磷酸化水平降低(P<0.05)，C組RAS 蛋白表達(dá)增多，RAF及ERK磷酸化水平升高(P<0.05)；與B組比較，C組RAS 蛋白表達(dá)增多，RAF及ERK磷酸化水平升高(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

3 討論

VSMCs是血管壁的主要實(shí)質(zhì)細(xì)胞，炎癥、免疫反應(yīng)及剪切力等因素作用使其異常增殖及凋亡減少是AS、HP及PTA后再狹窄等VPD發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制。因此，VSMCs作為“參與者”在VPD發(fā)病中起關(guān)鍵作用，研究如何有效抑制VSMCs增殖并適當(dāng)促進(jìn)其凋亡對(duì)防治上述疾病至關(guān)重要。

IFN是最早應(yīng)用于臨床的基因工程藥物之一，其抗病毒、調(diào)節(jié)免疫及抗腫瘤作用及其機(jī)制已明確[4-6，12-13]。IFN可影響跨膜信號(hào)傳遞、蛋白激酶激活、蛋白磷酸化及細(xì)胞基因表達(dá)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[2，7，13]。P204是IFN誘導(dǎo)蛋白P200家族的鼠類蛋白成員，IFN-α可誘導(dǎo)P204表達(dá)而抑制大鼠VSMCs增殖及其部分機(jī)制已明確[9]，但I(xiàn)FN-α對(duì)VSMCs凋亡的影響及其機(jī)制尚未完全明了。本研究顯示，IFN-α干預(yù)后P204 mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)，VSMCs凋亡增多，進(jìn)一步證實(shí)P204表達(dá)存在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的IFN-α誘導(dǎo)性，提示IFN-α可誘導(dǎo)P204表達(dá)而促進(jìn)VSMCs凋亡。IFN-α除通過(guò)誘導(dǎo)P204表達(dá)而抑制VSMCs增殖外是否尚存在其他機(jī)制？RAS信號(hào)傳導(dǎo)途徑是與細(xì)胞增殖、凋亡及分化密切相關(guān)的信號(hào)途徑之一。細(xì)胞外信號(hào)刺激激活RAS，激活型RAS逐級(jí)磷酸化活化RAF及MEK，最終活化ERK而產(chǎn)生促進(jìn)細(xì)胞增殖及抑制細(xì)胞凋亡等生物學(xué)效應(yīng)。本研究表明，單純IFN-α干預(yù)可誘導(dǎo)P204 mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)，伴RAS蛋白表達(dá)減少，其下游蛋白R(shí)AF及ERK磷酸化水平下降，VSMCs凋亡增多；IFN-α干預(yù)后再轉(zhuǎn)染IFI204 siRNA，P204 mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào)，RAS蛋白表達(dá)增多，RAF及ERK磷酸化水平升高，VSMCs凋亡減少，顯示IFI204 siRNA對(duì)P204在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平的抑制作用，RAS蛋白表達(dá)及其下游信號(hào)蛋白R(shí)AF及ERK的磷酸化水平與P204呈反向變化趨勢(shì)，提示RAS信號(hào)途徑可能參與IFN-α促進(jìn)VSMCs凋亡過(guò)程的調(diào)控。

Ⅰ.電泳圖；Ⅱ.柱形圖；與A組比較，*1P<0.05；與B組比較，*2P<0.05

圖3 3組大鼠VSMCs RAS蛋白表達(dá)和RAF及ERK磷酸化水平的比較(n=3)

Ⅰ.electrophotogram；Ⅱ.histogram；compared with group A，*1P<0.05；compared with group B，*2P<0.05

Fig.3 Comparison of the expression of RAS protein and the phosphorylation levels of RAF and ERK in VSMCs among three groups of rats(n=3)

綜上所述，IFN-α可誘導(dǎo)P204表達(dá)而促進(jìn)VSMCs凋亡，P204及RAS信號(hào)途徑可能參與IFN-α誘導(dǎo)大鼠VSMCs凋亡過(guò)程的調(diào)控，但P204與RAS信號(hào)途徑之間的相互作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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Inducement Effect of Interferon Alpha on Apoptosis of Rat Vascular Smooth Muscle Cells via P204 and RAS Signal Pathway

LONG Xiangshu1, WU Qiang1, LIU Taihe2, SONG Fang1, HUANG Jing1, TIAN Maobo1, XIAO Yan1

(1.DepartmentofCardiology,GuizhouProvincialPeople’sHospital,Guiyang550002,China；2.DepartmentofInstituteofMathematicsandComputerScience,AnshunCollege,Anshun561000,China)

Objective To investigate the effect of interferon alpha (IFN-α) on apoptosis of vascular smooth muscle cells (VSMCs) in rats and the related mechanism. Methods The cells were divided into three group: group A, group B and group C.Group A was transfected with nonspecific siRNA, group B was intervened with IFN-α and transfected with nonspecific siRNA, and group C was intervened with IFN-α and transfected with IFI204 siRNA.All the cells were cultured for 48 h.The expression of P204 mRNA was determined by semiquantitative reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR).P204, RAS protein levels, and phosphorylation levels of RAF and ERK were analyzed by Western blotting.The cell apoptosis was analyzed by flow cytometry with Annexin-V FITC/PI method. Results As compared with group A, the expression of P204 mRNA and protein in group B was up-regulated (P<0.05), the cell apoptosis was increased (P<0.05), in the process of the above, the expression of RAS protein was decreased (P<0.05) and the phosphorylation levels of RAF and ERK were dropped (P<0.05).In group C, the expression levels of P204 mRNA and protein were down-regulated (P<0.05), and cell apoptosis was decreased (P<0.05), the expression of RAS protein and the phosphorylation levels of RAF and ERK were increased (P<0.05). Conclusion P204 and RAS signal pathway participates in IFN-α regulation of apoptosis of VSMCs in rats.

Interferon； Vascular smooth muscle cells； Interferon induction protein 204； RAS signal pathway； Apoptosis

2014-12-15

2015-03-05

*國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81260030)；貴州省科技攻關(guān)項(xiàng)目(黔科合LH字[2014]7023號(hào))

龍向淑(1977-)，女，貴州天柱人，主治醫(yī)師，碩士，主要從事冠心病、心力衰竭發(fā)病基礎(chǔ)與臨床的研究。電話：(0)15285646460，E-mail：928602548@qq.com。

吳強(qiáng)(1969-)，男，廣東雷州人，主任醫(yī)師，博士，主要從事冠心病、心力衰竭發(fā)病基礎(chǔ)與臨床防治的研究。電話：(0)13984112269，E-mail：gzgywq@126.com。

R965；R972

A

1004-0781(2015)12-1555-04

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.12.002