鐘興明，韋相才，朱國平，李艷秋，伍園園，李志才，郭建華，曾幸榮

（1.廣東省計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究所，廣州510600；2.華南理工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，廣州510500）

囊型宮內(nèi)節(jié)育器避孕材料的細(xì)胞毒性研究

鐘興明1，韋相才1，朱國平1，李艷秋1，伍園園1，李志才2，郭建華2，曾幸榮2

（1.廣東省計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究所，廣州510600；2.華南理工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，廣州510500）

目的：對(duì)囊型宮內(nèi)節(jié)育器避孕材料的細(xì)胞毒性的潛在性作出評(píng)價(jià)。方法：采用研制的硅橡膠材料與高密度聚乙烯材料作為對(duì)照，根據(jù)GBT 16886.5―2003醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第5部分標(biāo)準(zhǔn)，設(shè)立空白對(duì)照組、陰性對(duì)照（高密度聚乙烯）浸提液組、陽性對(duì)照液（含6.3%苯酚的RPMI1640完全培養(yǎng)液）組、100%、50%和25%材料（硅橡膠）浸提液組共6個(gè)組；用RPMI 1640完全培養(yǎng)液培養(yǎng)L-929細(xì)胞，每組加入100 μL的空白對(duì)照液、陰性對(duì)照浸提液和25%、50%、100%的材料浸提液及陽性對(duì)照液，觀察細(xì)胞形態(tài)和增值率。結(jié)果：空白對(duì)照組、陰性對(duì)照浸提液組、陽性對(duì)照組、100%、50%和25%濃度材料浸提液組的細(xì)胞毒性級(jí)別分別為：0級(jí)、1級(jí)、4級(jí)、2級(jí)、2級(jí)、1級(jí)。100%、50%和25%材料浸提液組培養(yǎng)72 h后細(xì)胞增值率分別是（66.2±4.3）%、（72.4±6.1）%、（81.1±4.2）%；陰性對(duì)照浸提液組、100%、50%、25%材料浸提液組和陽性對(duì)照浸提液組OD（optical density）值與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；空白對(duì)照組、100%、50%材料浸提液和陽性對(duì)照液組OD值與陰性對(duì)照浸提液組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；25%材料浸提液OD值和與陰性對(duì)照浸提液組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論：根據(jù)GBT 16886.5―2003醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第11部分標(biāo)準(zhǔn)，所測硅橡膠材料細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)符合要求。

宮內(nèi)節(jié)育器；硅橡膠材料；細(xì)胞毒性；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)；鼠

1 前言

放置宮內(nèi)節(jié)育器（IUD）是我國育齡婦女最常用的避孕方法之一，約占40%左右[1]。我國是一個(gè)人口大國，計(jì)劃生育是一項(xiàng)長期的基本國策，近年來全國IUD使用的流行病學(xué)調(diào)查顯示IUD使用后的一些副反應(yīng)如子宮異常出血和不適感等副反應(yīng)仍未能較好地解決[2]。如何消除或減輕放置IUD后所產(chǎn)生的各種副作用、增加使用者的舒適程度，是一個(gè)迫切需要解決的難題。本研究根據(jù)囊型IUD[3]的設(shè)計(jì)特點(diǎn)，筆者研制出新配方的硅橡膠材料用于囊型IUD的制作。為了評(píng)價(jià)這種高分子聚合材料的細(xì)胞毒性，為臨床的安全使用提供依據(jù)和資料，本實(shí)驗(yàn)對(duì)此材料的細(xì)胞毒性進(jìn)行了研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

2 資料和方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料與主要試劑

1）實(shí)驗(yàn)材料：硅橡膠材料[4]（配方：100質(zhì)量份乙烯基硅油；40質(zhì)量份氣相二氧化硅；10質(zhì)量份六甲基二硅氮烷）由華南理工大學(xué)材料學(xué)院提供；高密度聚乙烯由廣州華粵行儀器有限公司提供。

2）實(shí)驗(yàn)溶劑：RPMI1640完全培養(yǎng)液（含RPMI1640培養(yǎng)液、青霉素/鏈霉素，胎牛血清）；批號(hào)：8112835、12110511、NWJ0473；級(jí)別：細(xì)胞級(jí)；有效期至：2013-06-19；生產(chǎn)單位：GIBCO、杭州吉諾生物醫(yī)藥有限公司、Hyclone。

2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞培養(yǎng)

采用小鼠成纖維細(xì)胞L-929。來源：中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心細(xì)胞庫。于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心細(xì)胞室，37℃、飽和濕度和5%二氧化碳的環(huán)境培養(yǎng)。于100 mm培養(yǎng)皿加入10 mL RPMI1640完全培養(yǎng)液。待細(xì)胞長至80%～90%匯合時(shí)，棄去原培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖溶液（PBS）液洗滌2次，0.25%胰酶消化1 min，吸棄胰酶，加入RPMI1640完全培養(yǎng)液。

2.3 細(xì)胞檢查

對(duì)傳代細(xì)胞觀察3 d。期間每日檢查細(xì)胞一次，細(xì)胞未見異常，培養(yǎng)液未見異常，該株細(xì)胞納入實(shí)驗(yàn)。

2.4 劑量設(shè)計(jì)與分組

細(xì)胞毒性：依據(jù)GBT 16886.5―2003《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第5部分體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)》，設(shè)立空白對(duì)照組、陰性對(duì)照浸提液組、陽性對(duì)照液組、100%、50%和25%濃度的材料A浸提液組，共6個(gè)組。

2.5 浸提液的制備

1）供試品浸提液的制備：稱取4.0 g材料，用純凈水沖洗干凈，用濾紙吸干后，制成10 mm×50 mm塊狀，進(jìn)行115℃高壓滅菌30 min，以含RPMI1640完全培養(yǎng)液為浸提介質(zhì)，按照0.2 g樣品/mL浸提介質(zhì)，37℃振蕩浸提24 h，分別制備出浸提液20 mL。取上清液作為100%樣品浸提液，然后用RPMI1640完全培養(yǎng)液配成50%和25%濃度。

2）陰性對(duì)照液提液的制備：準(zhǔn)確稱取2.0 g高密度聚乙烯材料，用純凈水沖洗干凈，用濾紙吸干后，剪成約10 mm×50 mm塊狀，進(jìn)行Co60輻照滅菌，以含RPMI1640完全培養(yǎng)液作為浸提介質(zhì)，按照0.2 g樣品/mL浸提介質(zhì)，37℃振蕩浸提24 h，制備出浸提液10 mL。

3）陽性對(duì)照液提液的制備：含6.3%苯酚的RPMI1640完全培養(yǎng)液。

4）空白對(duì)照液提液的制備：不含供試品材料的RPMI1640完全培養(yǎng)液。在浸提期間，置于與供試品材料同樣的容器中并采用同樣的浸提條件。

2.6 實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果評(píng)價(jià)

1）實(shí)驗(yàn)方法：用RPMI1640完全培養(yǎng)液培養(yǎng)L-929細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到其對(duì)數(shù)生長期末細(xì)胞趨于融合時(shí)，用消化液消化細(xì)胞，用細(xì)胞培養(yǎng)液制成1×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液；將細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL，輕輕水平轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)板使細(xì)胞均勻地分散在皿孔表面；置37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；棄去原培養(yǎng)液，每組加入100 μL的空白對(duì)照液、陰性對(duì)照浸提液、25%、50%和100%濃度的材料A浸提液、陽性對(duì)照液，每組設(shè)8孔（不使用邊緣孔，邊緣孔用PBS填充）；置CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)；每孔加入噻唑蘭（MTT）溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄去孔內(nèi)液體，每孔加二甲基亞砜（DMSO）150 μL，輕輕振蕩10 min；用酶標(biāo)儀測定每孔的吸光度，測定波長為570 nm，參考波長為630 nm。

3）RGR與細(xì)胞毒性分級(jí)的關(guān)系判斷標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)，RGR≥100%；1級(jí)，RGR為80%～99%；2級(jí)，RGR為50%～79%；3級(jí)，RGR為30%～49%；4級(jí)，RGR為0%～29%（要求陰性對(duì)照組的反應(yīng)不大于1級(jí)，陽性對(duì)照組反應(yīng)大于3級(jí)）。

3 結(jié)果

3.1 各組的細(xì)胞毒性級(jí)別

6組的細(xì)胞毒性如下所示。空白對(duì)照組：0級(jí)；陰性對(duì)照浸提液組：1級(jí)；陽性對(duì)照組：4級(jí)；100%濃度材料浸提液組：2級(jí)；50%濃度材料浸提液組：2級(jí)；25%濃度材料浸提液組：1級(jí)。

3.2 各組的細(xì)胞增殖率測定

100%濃度材料浸提液組、50%濃度材料浸提液組、25%濃度材料浸提液組培養(yǎng)72 h后細(xì)胞OD值分別是0.694±0.045、0.759±0.0364和0.850±0.044；RGR值分別是（66.2±4.3）%、（72.4±6.1）%、（81.1±4.2）%。陰性對(duì)照浸提液組（OD值為0.914±0.065，RGR為（87.2±6.2）%）、100%濃度材料浸提液組、50%濃度材料浸提液組、25%濃度材料浸提液組和陽性對(duì)照浸提液組（OD值為0.190± 0.011，RGR為（18.1±1.1）%）與空白對(duì)照組（OD值為1.047±0.053，RGR為（100.0±5.1）%）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.78，P＜0.05）；空白對(duì)照組、100%濃度材料浸提液組、50%濃度材料浸提液組和陽性對(duì)照液組OD值與陰性對(duì)照浸提液組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.04，P＜0.05）。

3.3 細(xì)胞毒性光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果

在細(xì)胞培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后分別倒置顯微鏡觀察可見：空白對(duì)照組細(xì)胞貼壁生長，數(shù)量逐漸增加，折光性強(qiáng)，多為長梭形和多角形，并見圓形分裂狀態(tài)細(xì)胞；在培養(yǎng)72 h后，陰性對(duì)照浸提液組約85%以上的細(xì)胞形態(tài)正常、貼壁生長良好、胞漿內(nèi)有離散顆粒，偶見細(xì)胞溶解；陽性對(duì)照液組細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞變圓縮小、甚至崩解；25%材料浸提液組從培養(yǎng)48 h后開始有細(xì)胞圓縮，可見一小部分的細(xì)胞溶解，在培養(yǎng)72 h后，約有20%的細(xì)胞呈圓形或溶解；50%、100%材料浸提液組從培養(yǎng)48 h后開始有細(xì)胞圓縮，明顯可見細(xì)胞溶解和細(xì)胞間空間，在培養(yǎng)72 h后，約有30%、35%的細(xì)胞呈圓形或溶解（見圖1）。

圖1 6組細(xì)胞培養(yǎng)72 h光學(xué)顯微鏡圖片F(xiàn)ig.1 Optical microscope images of six groups of cell to culture 72 h

4 討論

放置IUD是目前公認(rèn)的一種放置時(shí)間較長、安全可靠、長效簡便、經(jīng)濟(jì)和可逆的避孕方法。經(jīng)數(shù)代研究者努力，IUD的有效性和安全性都有了顯著的提高，大大提高了育齡婦女對(duì)IUD的接受性。國內(nèi)外研制出的不同類型的IUD，各有優(yōu)劣：如活性IUD的避孕效果好于惰性IUD，失敗率降低；IUD的銅面積越大，避孕失敗率越低；含孕激素IUD雖避孕失敗率低，但易出現(xiàn)閉經(jīng)等副反應(yīng)；新型無支架的GyneFix在降低脫落率、妊娠率方面優(yōu)于Tcu380A IUD，但放置失敗率較高[5]。目前，眾多類型的仍存在脫落、妊娠、出血、疼痛等副反應(yīng)[6]，影響了IUD的推廣使用。通過對(duì)IUD使用的流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，IUD的質(zhì)量及在子宮腔中面積大小和類型與放置IUD后月經(jīng)失血量的多少、疼痛、脫落和意外妊娠有關(guān)[7]。為了適應(yīng)子宮在靜止或收縮時(shí)的形態(tài)，增強(qiáng)宮腔對(duì)IUD的適應(yīng)性，人們發(fā)明了多種形態(tài)各異的IUD，但是仍然不能完全擺脫上述副作用的困擾。目前使用較多的圓型、元宮型及T型IUD等均是以金屬或塑料為支架，加上銅套或銅線，放置到子宮內(nèi)發(fā)揮其避孕作用。隨著妊娠病理、生理的深入研究和相關(guān)學(xué)科的發(fā)展，人們對(duì)IUD避孕原理的認(rèn)識(shí)進(jìn)一步加深，要求對(duì)IUD形態(tài)和材料進(jìn)行相應(yīng)的改進(jìn)和革新。因此，研制一種新型宮內(nèi)節(jié)育器，在不影響IUD避孕效果的基礎(chǔ)上減輕IUD的副反應(yīng)具有顯著的臨床意義。

筆者根據(jù)IUD與宮腔有效接觸可阻止妊娠的原理，利用球囊的可變形性和可擴(kuò)張性，一方面使之與子宮內(nèi)膜有盡可能大的接觸面積從而阻礙胚胎的著床，有效阻止妊娠；另一方面也增加IUD在宮腔內(nèi)的順應(yīng)性，使IUD的形狀和大小與宮腔的形態(tài)盡可能相適應(yīng)，從而減少脫落及不適感的發(fā)生。硅橡膠對(duì)人體無刺激具有良好的生物相容性，作為長期植入體內(nèi)的材料已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用。其性質(zhì)主要與直鏈聚硅氧烷的化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)，其分子主鏈由Si―O―Si鏈組成，具有優(yōu)良的熱氧化穩(wěn)定性，在用于人體的時(shí)候表現(xiàn)出了無毒及生理惰性，與皮膚接觸不引起刺激，具有選擇透氣性、緩釋的功能。利用其這一特點(diǎn)，設(shè)想利用特殊的硅橡膠制作成IUD置入宮腔可以有效地減輕IUD對(duì)子宮內(nèi)膜的刺激，避免現(xiàn)有IUD的副作用。在參考目前常用的植入人體的醫(yī)用材料基礎(chǔ)上，筆者研制出特定配方的醫(yī)用硅橡膠材料用于囊型IUD的制作，此種材料具有重量輕、軟硬適中、具有一定的彈性、耐腐蝕性和一定控釋性等性能，這樣一方面不增加IUD本身的質(zhì)量，另一方面又可以減輕對(duì)子宮的刺激。筆者研究在對(duì)囊型IUD的形態(tài)與規(guī)格進(jìn)行合理設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上，對(duì)研制的高分子硅橡膠材料性能進(jìn)行測試，對(duì)其細(xì)胞毒性的潛在性作出評(píng)價(jià)。選用小鼠成纖維細(xì)胞L-929，通過不同濃度的供試材料浸提液培養(yǎng)細(xì)胞后觀察細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞增值率。結(jié)果根據(jù)GBT 16886.5―2003醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第11部分標(biāo)準(zhǔn)判定，所測囊型宮內(nèi)節(jié)育器避孕材料細(xì)胞毒性分別為2級(jí)、2級(jí)、1級(jí)，為臨床的安全使用提供依據(jù)。

[1] 鄒 燕，雷貞武.宮內(nèi)節(jié)育器的流行病學(xué)研究近況[J].實(shí)用婦產(chǎn)科雜志，2003，19（6）：321-323.

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Study on cytotoxicity of contraceptive materials of scrotiform intrauterine device

Zhong Xingming1，Wei Xiangcai1，Zhu Guoping1，Li Yanqiu1，Wu Yuanyuan1，Li Zhicai2，Guo Jianhua2，Zeng Xingrong2
（1.Guangdong Family Planning Research Institute，Guangzhou 510600，China；2.School of Materials Science and Engineering，South China University of Technology，Guangzhou 510500，China）

Objective：To evaluate the cytotoxicity of contraceptive materials of scrotiform intrauterine device（IUD）.Method：Make a cytotoxicity experiment with the additional liquid sil-icone rubber newly developed（formula：vinyl silicone oil，hydrogen silicone oil，and 1-ethynylcyclohexanol）in accordance with Part 5 of GBT 16886.5―2003 Biological Evaluation of Medical Devices.Six groups in total including blank control group（with no RPMI1640 complete culture solution of the experimental material），negative control extract solution group（high density polyethylene material），positive control solution group（with RPMI1640 complete solution of 6.3%phenol），100%，50%and 25%material extract group were set.Cultivate L-929 cell with RPMI1640 complete culture medium；add 100 μL blank control solution，negative extract solution and 25%，50%and 100%material extract solutions，and observe cellular morphology under the microscope；and measure OD（optical density）value with a microplate reader and observe proliferation rate of the cells.Results：Blank control group，negative control extract solution group，positive control solution group，100%，50%，25%material extract group’s cell cytotoxicity of experimental materials are in level 0，1，4，2，2 and 1 respectively.After 72 hours，25%，50%and 100%material extract solution had（66.2± 4.3）%，（72.4±6.1）%，and（81.1±4.2）%cell proliferation.The OD value differences of negative control extract solution group，100%，50%，25%material extract solution group and positive control extract solution group own statistical significance（P＜0.05），the OD value differences of blank control group，100%，50%，25%material extract solution group and negative control extract solution group own statistical significance（P＜0.05）；the OD value difference of 25%material extract solution group and negative control extract solution group does not own statistical significance（P＞0.05）.Cell cytotoxicity of experimental materials are in level 2，2 and 1 respectively.Conclusion：Accordance with Part 11 of GBT 16886.5―2003 Biological Evaluation of Medical Devices，experimented silicone rubber material complies with the requirements for cell cytotoxicityexperiment of biological materials and medical devices.

intrauterind device；silicone rubber material；cytotoxicity；animal experiment；mouse

R318.08

A

1009-1742（2015）06-0008-05

2015-04-25

廣東省科技廳基金資助項(xiàng)目（2010B031600175）；廣東省人口與計(jì)劃生育委員會(huì)基金資助項(xiàng)目（2010201）

鐘興明，1973年出生，女，貴州赤水市人，碩士，主任醫(yī)師，主要從事計(jì)劃生育、生殖內(nèi)分泌和宮內(nèi)節(jié)育器研制方面的工作；E-mail：xingmingzh@126.com