余宏亮，常明秀，曹恒海，薄立偉，楊永俊，李聰敏，李 銘

（河南省人口和計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究院，鄭州450002）

人參皂苷CK、淫羊藿苷對體外培養(yǎng)精子的劑量負(fù)荷試驗(yàn)

余宏亮，常明秀，曹恒海，薄立偉，楊永俊，李聰敏，李 銘

（河南省人口和計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究院，鄭州450002）

目的：項(xiàng)目擬通過觀察在培養(yǎng)液中加入較高劑量的人參皂苷CK（Ginsenoside，G組）、淫羊藿苷（Icraiin，I組）兩種藥物前、后精子死亡率數(shù)據(jù)，評估兩種藥物單體在較大劑量時(shí)對體外精子的死亡率的影響。方法：新鮮液化的精液（semen）標(biāo)本40份，F(xiàn)-10培養(yǎng)液調(diào)整濃度為1.0×107/mL，分別添加不同劑量的人參皂苷CK（Ginsenoside，Gin CK）、淫羊藿苷（Icraiin，Icr）按照不同藥物濃度，G組分為500 μg/mL組（G1組），100 μg/mL組（G2組），I組分為500 μg/mL（I1組），100 μg/mL（I2組）；設(shè)不添加任何物質(zhì)的F-10組（F-10，F(xiàn)組）為陰性對照組，培養(yǎng)24 h后分別檢查各組精子活動率和死亡率。結(jié)果：培養(yǎng)24 h后，精子死亡率從低到高分別是培養(yǎng)24 h后，I2組死亡率為41.31±17.49，F(xiàn)組死亡率為47.50±19.85，G2組死亡率為55.75± 24.93，I3組死亡率為58.05±19.06，G1組死亡率為98.84±1.62。精子死亡率從低到高分別是I2組、F組、G2組、I1組、G1組，各組比較有差異（P＜0.05）。結(jié)論：較大劑量的Gin CK、Icr，均可引起體外培養(yǎng)的精子死亡率增高；在0.1 mg/mL的濃度下的Gin CK對精子的致死作用已經(jīng)比較明顯，而0.5 mg/mL對體外培養(yǎng)精子來說是致死劑量（98.84%），在0.1 mg/mL的劑量下的淫羊藿苷對精子的致死作用并不明顯，在0.5 mg/mL劑量下Icr對精子致死作用有所提高，但遠(yuǎn)未達(dá)到Gin CK 98.4%的致死率。

人參皂苷CK；淫羊藿苷；精子；致死劑量

1 前言

根據(jù)相關(guān)報(bào)導(dǎo)的有效作用劑量[1，2]，本研究擬通過觀察在培養(yǎng)液中加入較大劑量的人參皂苷CK（Ginsenoside，Gin CK）、淫羊藿苷（Icraiin，Icr）前、后精子死亡率數(shù)據(jù)，了解其對體外精子死亡率的影響，以便篩對兩者安全選出療效確切，藥物成分明確，藥理機(jī)制透徹的中藥單體制劑，減少患者和醫(yī)生的選擇盲目性。

2 資料和方法

2.1 資料

本院化驗(yàn)室檢驗(yàn)用后廢棄精液標(biāo)本40份（經(jīng)患者同意并經(jīng)院倫理委員會批準(zhǔn)），精子濃度少于1.0×107/mL的不納入。

2.2 方法

F-10培養(yǎng)液調(diào)整濃度為1.0×107/mL，分別添加不同劑量的人參皂苷CK（Ginsenoside，G組；C36H62O18，分子量為622.87）、淫羊藿苷（Icraiin，I組；C33H40O15，分子量為676.65），按照不同濃度，G組分為500 μg/mL組（G1組），100 μg/mL組（G2），I組分為500 μg/mL（I1組），100 μg/mL（I2組）；設(shè)不添加任何物質(zhì)的F-10組（F組）為陰性對照組，34℃培養(yǎng)24 h后分別檢查各組精子死亡率。

2.3 檢測方法

人參皂苷CK，水溶性VE用F-10培養(yǎng)液溶解后使用；淫羊藿苷用先用二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide或DMSO）溶解，在使用前用添加至F-10液使用；死亡率（伊紅染色，Eosin）參照《世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊》第五版[3]精子死亡率檢測方法。

2.4 試劑、儀器設(shè)備及軟件

Gin CK（美侖生物），Icr（美侖生物），伊紅（Sigma），DMSO（永大），其他國產(chǎn)分析純、離心機(jī)（國產(chǎn)）、移液器（國產(chǎn)）、全自動精子分析系統(tǒng)（Proiser）、Nikon ECLIPSE E200（Nikon）。

2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

SPSS13.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，檢測數(shù)據(jù)用Mean±s表示，對多組比較采用方差分析檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

3 試驗(yàn)結(jié)果

1）培養(yǎng)24 h后，I2組死亡率為41.31±17.49，F(xiàn)組死亡率為47.50±19.85，G2組死亡率為55.75±24.93，I3組死亡率為58.05±19.06，G1組死亡率為98.84± 1.62。

2）精子死亡率從低到高分別是I2組、F組、G2組、I1組、G1組，各組經(jīng)伊紅染色后的死亡率有顯著差異（P＜0.05），見表1。

表1 精子死亡率及排序（由低到高）Table 1 The values of mortality for human semen（from low to high）

4 討論

中藥治療男性不育方面的藥物及組方很多，但由于中醫(yī)藥的藥物成分復(fù)雜，作用靶點(diǎn)多，藥物作用機(jī)理難以明確[4]，而中藥單體的研究相對容易，因此，中藥單體治療男性不育的研究逐漸成為男科臨床的熱點(diǎn)之一[5]。中醫(yī)認(rèn)為，男性不育以虛證為主，多施以溫補(bǔ)之藥，人參和淫羊藿是男科臨床的常用藥物，其中的有效成分主要是人參皂苷和淫羊藿苷，動物研究表明在改善精子質(zhì)量方面具有良好療效[6]，但是有關(guān)二者單體成分的致死劑量即單位體積的最大負(fù)荷劑量未見報(bào)導(dǎo)，藥物安全性方面的研究也多未涉及。

Gin是人參中的主要活性成分，Gin CK是天然的二醇型人參皂苷在人腸道內(nèi)的代謝產(chǎn)物，是人參在體內(nèi)發(fā)揮活性的實(shí)體[7]，且有良好的水溶性。研究表明[8]，Gin CK是一個(gè)多靶點(diǎn)、高活性化合物，有研究表明其在抗腫瘤、抗炎、保肝和抗過敏方面體現(xiàn)了良好的活性，而且在神經(jīng)系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)方面也具有很好的調(diào)節(jié)作用[9]。淫羊藿是男科臨床治療不育癥的常用藥[10]，現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)研究表明，淫羊藿能增加血管血流量、促進(jìn)造血功能、免疫功能及代謝，具有抗衰老、抗腫瘤等功效[11]，Icr是淫羊藿的主要活性成分，是現(xiàn)代男科藥物研究領(lǐng)域的主要對象之一[12]，由于難溶于水，其作為細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域的研究對象時(shí)多用二甲基亞砜溶解后使用。

根據(jù)文獻(xiàn)[13]報(bào)道，集既往經(jīng)驗(yàn)，不同個(gè)體精子的精子活動率相差懸殊，即使同一個(gè)體，同一標(biāo)本，同一分析人員，同一精子分析系統(tǒng)做出的結(jié)果往往有較大誤差，特別是該標(biāo)本精子活動率較高時(shí)，在短時(shí)間內(nèi)做體外培養(yǎng)時(shí)（特別是培養(yǎng)液中的藥物作用相近時(shí)）該種誤差減少程度有限，而當(dāng)培養(yǎng)24 h以上時(shí)，不同藥物及劑量下的精子活動率減少有顯著差異，可有效避免相關(guān)統(tǒng)計(jì)誤差，伊紅染色觀察精子死亡率簡單快速，一般誤差較小，培養(yǎng)時(shí)間的選擇和死亡率方法的正確選擇有助于提高統(tǒng)計(jì)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

本次項(xiàng)目通過對Gin CK、Icr等藥物單體成分的進(jìn)行深入的臨床研究，觀察了其在體外對精子質(zhì)量的影響：a.較大劑量的Gin CK、Icr，均可引起體外培養(yǎng)的精子死亡率增高，在0.1 mg/mL的濃度下的Gin CK對精子的致死作用已經(jīng)比較明顯，而0.5 mg/mL對體外培養(yǎng)精子來說是致死劑量（98.84%），在0.1 mg/mL的劑量下的淫羊藿苷對精子的致死作用并不明顯，在0.5 mg/mL劑量下Icr對精子致死作用開始顯現(xiàn)；b.Icr對精子的細(xì)胞毒性作用非常微弱，而大劑量的Gin CK對精子的細(xì)胞毒性作用非常顯著。

[1] 陳 智，劉繼紅，尹春萍，等.人參皂甙Rb1體外對人精子運(yùn)動參數(shù)的影響[J].中國男科學(xué)雜志，2006，20（6）：6-8.

[2] 楊 欣，張永華，丁彩飛，等.應(yīng)用體外培養(yǎng)法研究淫羊藿水提物對人精子膜功能損傷的保護(hù)作用[J].中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2007，1（6）：663-667.

[3] 國家人口和計(jì)劃生育委員會科學(xué)技術(shù)研究所，等.世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2011.

[4] 于慶生，余宏亮，潘晉方，等.芪黃煎劑對缺血-再灌注大鼠腸黏膜上皮細(xì)胞Bcl-2、Bax及Caspase-3、9 mRNA表達(dá)的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2011，31（2）：223-227.

[5] 余宏亮，于慶生，潘晉方，等.芪黃煎劑對缺血-再灌注大鼠腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2009，29（12）：1096-1099.

[6] 余宏亮，薄立偉，曹恒海，等.男性染色體斷裂率增高的中醫(yī)藥治療[J].遼寧中醫(yī)雜志，2014，46（6）：1169-1170.

[7] 王 筠，侯金才，向麗華，等.梔子苷與人參皂苷Rg1配伍對缺氧誘導(dǎo)損傷小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子分泌的平衡調(diào)節(jié)作用[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2014，34（1）：94-95.

[8] 周 偉，羅振時(shí)，周 颯.反相高效液相色譜法測定人參皂甙Compound—K的含量[J].色譜，2005，23（3）：270-272.

[9] 張大雷，楊搖蓓，吳搖磊，等.人參皂苷保護(hù)小鼠精原細(xì)胞氧化損傷的研究[J].中國藥理學(xué)通報(bào)，2010，26（8）：1014-1016.

[10] 李 丹，魏莎莉，謝 怡，等.淫羊藿苷對糖尿病大鼠睪丸中亞硝基谷胱甘肽還原酶及Bcl2的影響[J].解剖學(xué)雜志，2013，36（1）：27-28.

[11] 高學(xué)勇，林 珊，韓咪莎.淫羊藿苷調(diào)節(jié)雄性大鼠生殖功能[J].解剖學(xué)雜志，2013，36（4）：799.

[12] 王嘉琪，李雪雁，吳河龍，等.淫羊藿苷對體外培養(yǎng)大鼠股骨組織的影響[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18（15）：199.

[13] Cooper T G，Noonan E，Sigrid von Eckardstein，et al.World Health Organization reference values for human semen characteristics[J].HumanReproductionUpdate，2009，16（3）：231-245.

The lethal dose test of Ginsenoside CK and Icraiin for sperm in vitro

Yu Hongliang，Chang Mingxiu，Cao Henghai，Bo Liwei，Yang Yongjun，Li Chongmin，Li Ming
（Henan Province Research Institute for Population and Family Planning，Zhengzhou 450002，China）

Objective：To investigate the effects of Ginsenoside CK（Gin CK），Icraiin（Icr）for sperm survive in vitro.Methods：40 sample of male semen were cultured in medium and grouped it in vitro，To adjust the semen concentration is 1.0×107/mL by culture medium of F-10（F-10），To add respect Ginsenoside（Gin1group，500 μg/mL；Gin2group，100 μg/mL），Icraiin（Icr1group，500 μg/mL；Icr2group，100 μg/mL）were added respectively.F-10 alone was the control groups.To compare with them of groups sperm tmortality.Results：The values of sperm mortality after cultured for 24 h.The motality of I2group was 41.31±17.49，F(xiàn) group was 47.50± 19.85，G2group was 55.75±24.93，I3group was 58.05±19.06，G1group was 98.84±1.62.Ranking them from less to more motality were I2groups，F(xiàn) groups，G2groups，I1groups，G1group s（P＜0.05）.Conclusion：When the concentration was 0.1 mg/mL，Gin CK can increase the sperm mortality significantly and Icr was not；When the concentration was 0.5 mg/mL，it is the lethal dose for Gin CK and Icr can increase the sperm mortality but it is not.

Ginsenoside CK；Icraiin；sperm；lethal dose

R394

A

1009-1742（2015）06-0086-03

2015-03-10

河南省屬科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（2014JBKY006）

余宏亮，1978年出生，男，河南衛(wèi)輝市人，主治醫(yī)師，研究方向?yàn)樯辰】?；E-mail：hongliangyu19780@sina.com