鄭雅嫻，呂文華

（中國林業(yè)科學(xué)研究院 木材工業(yè)研究所，北京100091）

棕櫚藤是僅次于木材和竹材的重要非木材林產(chǎn)品，能夠在維持天然生態(tài)環(huán)境的條件下，提供與伴生樹木相同甚至更多的使用效益，對替代木材和保護(hù)森林資源發(fā)揮著重要作用［1］。黃藤（Daemonorops margaritae）是我國特有的經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的多用途棕櫚藤。以棕櫚藤為原料制作的藤家具，享有工藝美術(shù)家具的美譽(yù)，是傳統(tǒng)的出口創(chuàng)匯商品之一。變色一般不影響藤材強(qiáng)度，但嚴(yán)重影響產(chǎn)品外觀品質(zhì)。變色菌通常侵染藤材表面，如不及時(shí)加以預(yù)防或控制，可從藤材表面滲透到內(nèi)部，導(dǎo)致深層變色［2］。由于菌絲的穿透作用，變色材滲透性和吸濕性增加，更易吸潮引起腐朽菌入侵。

國內(nèi)外研究表明，木材變色真菌有150多種，大多數(shù)屬于子囊菌和半知菌的Ceratocystis Sensu Lato，Ophiostoma Piceae 和 Verticicla Diella 屬［3］。有些腐朽菌也會引起木材變色，如紅木色孔菌Tinctoporellus epimiltinus （Berk.&Broome）Ryvarden［4-6］。我國竹材變色真菌多屬于半知菌亞門絲孢綱暗色孢科各屬，絲孢科（Hyphomycelaceae）的青霉屬（PenicilllumLink.）、曲霉屬（Aspergillus（Mich.）Link）和木霉屬（Trichoderma Pers.）等霉菌主要引起竹材綠、蘭、黃、紅、灰等變色［7-8］；暗色孢科 （Dematlaceae）的 枝 孢 霉 屬 （Cladosporium Link）、節(jié)棱孢屬（Arthrinum Kunze）、鏈格孢屬（Altemarla Nees）、輪枝孢屬（VerticilliumNees）等屬主要引起竹材褐變和黑變［9］。引起藤材變色的真菌與引起木材變色的真菌相似，使活立藤變色的主要真菌有：Colletotrichum gloeosporoides，F(xiàn)usariumspp.和Rhizoctonia solani等，侵染藤制品的變色真菌有：邊材變色菌Bostryodiplodia theobromae、Ceratostomella sp.、Aspergillus sp.、Cystospora calami Syd.、Cratocystis 屬、Diplodia 屬 和子囊菌科Melonomastia屬真菌和霉菌（Penicillium spp.、Trichoderma sp.、Fusariumspp.）等。白藤和單葉省藤上可分離出日本曲霉原變種（Aspergillus japonicas Saito var.Japonicus）、草酸青霉（Penicillium oxalicumCurrie Thorn）和可可毛殼色單隔孢 （Lasiodiplodia theobromae （Pat.）Griff.&Maub1.）和1種毛霉（Mucro spp.）［10］。地區(qū)不同侵染菌種不同，如南方常見的竹材尖孢枝孢和綠木霉在北方少見。

黃藤分布于中國南部如海南島、廣東東南部、廣西西南部、香港和云南西雙版納等地區(qū)，產(chǎn)地氣候溫暖濕潤，黃藤藤條原色多為乳白色或米黃色，但伐后顏色加深很快，呈黃色、紅黃色或棕黃色，尤其是在春夏高溫多雨季節(jié)，藤材在運(yùn)輸、存放、加工及使用過程中，容易發(fā)生藍(lán)變、褐變、紅變或黑斑等現(xiàn)象，大大降低藤材使用價(jià)值［11-12］。藤材變色防治，既提高藤材經(jīng)濟(jì)效益，也在一定程度上保護(hù)或節(jié)約棕櫚藤資源。對黃藤材變色菌進(jìn)行分離、培養(yǎng)和鑒定，通過藤材接種等試驗(yàn)，了解其變色的性質(zhì)和過程，可為藤材真菌變色的防治提供重要的理論基礎(chǔ)和實(shí)際指導(dǎo)。

本研究選取典型的變色黃藤材進(jìn)行變色真菌的分離和純化，通過對健全黃藤材的模擬接種試驗(yàn)，選擇對黃藤材顏色影響較大的幾種變色菌，首先根據(jù)真菌的菌絲形態(tài)、孢子產(chǎn)生的方式、形態(tài)和大小，結(jié)合培養(yǎng)特性等進(jìn)行形態(tài)學(xué)上的鑒定；再輔以DNA測序等分子生物學(xué)手段予以確認(rèn)。研究中真菌的形態(tài)學(xué)鑒定及其學(xué)名的采用，參照Ellis、Hawksworth、戴芳瀾［13-14］等人的著作。由于分生孢子有時(shí)難以發(fā)現(xiàn)或真菌難以產(chǎn)孢，菌落特征又可能因基因的異質(zhì)性有較大的變化，因此形態(tài)學(xué)鑒定真菌有一定的局限性［15］。利用真菌在rDNA的ITS區(qū)段具有保守性和在科、屬、種水平上均有特異性序列的特性，對ITS區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測序及序列分析，進(jìn)行分子鑒定，力求明確其準(zhǔn)確的分類地位，為藤材的變色防治提供更科學(xué)的依據(jù)［16］。

1 材料與方法

1.1 材料

黃藤（Daemonorops margaritae），采自廣東省肇慶市金雞坑林場，攀生于杉樹，約15年生。藤條直徑10～20mm，長15～25m，節(jié)間長度15～25 cm。選取典型的黃藤變色材進(jìn)行變色真菌的分離。用于接種變色菌的藤材，為藤全長1／3至2／3中部處的非節(jié)部健全藤莖加工成的藤片，試件尺寸為50 mm（順紋長度）×D（寬度，藤徑）×2mm（厚度）。

1.2 變色菌的分離和純化

選取典型黃藤變色材，用75%酒精消毒，再無菌水漂洗3次，輕輕刮去表層，切取小塊變色材，放在PDA平板培養(yǎng)基上，在溫度26～28℃，相對濕度75%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；采用尖端菌絲挑取法，挑取形態(tài)不同的菌落，轉(zhuǎn)到PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行純化；純化后的菌種轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基上，于4℃下保存?zhèn)溆?。PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200g／L，葡萄糖20g／L，瓊脂20g／L，自然pH值。平板培養(yǎng)基為直徑90mm的培養(yǎng)皿，斜面培養(yǎng)基為10mm×100mm試管。

1.3 變色菌的模擬接種

將分離、純化后的變色菌，采用菌懸液涂布法，回接到經(jīng)過濕熱滅菌（121℃，30min）的健全藤材上進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同分離與培養(yǎng)試驗(yàn)，觀察藤材變色情況與分離該菌的藤材變色是否一致，并重新從變色部位分離純化得到該菌，確定為藤材變色菌。

1.4 藤材顏色測定

將正常材和變色材在103℃下烘干，清除藤材表面的粉塵、菌絲和孢子，稱重，測色。采用國際照明委員會CIE L＊a＊b＊（1976）系統(tǒng)表色和計(jì)算色差［11］。采用日本MINLTA生產(chǎn)的CR-300臺式測色儀，D65標(biāo)準(zhǔn)光源，0／d（垂直照明／漫反射），測得色度學(xué)參數(shù)L＊（亮度）、a＊（藍(lán)綠指數(shù)）和b＊（黃紅指數(shù)），每種菌株3個(gè)重復(fù)，每片試材測3個(gè)點(diǎn)，取均值。

1.5 變色菌的形態(tài)學(xué)鑒定

將變色菌接種到PDA平板上，每種3個(gè)重復(fù)，觀察、記錄菌落生長速度、菌落形態(tài)、顏色及培養(yǎng)基變色情況，定期挑取菌絲，制成水載顯微切片，通過光學(xué)顯微鏡（Leica DM6000B-CTR6000），觀察菌絲形態(tài)、產(chǎn)孢與否、孢子形態(tài)和大小、分生孢子形狀等微觀特征，將未觀察到分類特征的菌株接種到瓊脂培養(yǎng)基上或通過液體搖培方式產(chǎn)孢，并結(jié)合培養(yǎng)特性進(jìn)行最終鑒定［17］。

1.6 變色菌的分子生物學(xué)鑒定

將菌絲置于研缽中液氮冷凍后研磨，采用O-mega公司試劑盒（EZNA Fungal DNA Kit）提取藤材變色菌總DNA。采用真菌通用引物ITS1（TCCGTAGGTGAAC CTGCGG）和 ITS4（TCCTCCGCTT ATTGA TATGC）［17］，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。利用北京冠普佳科技有限公司PCR擴(kuò)增試劑盒（PCR Amplification Kit），在基因擴(kuò)增儀上（ABI公司Veriti）進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min后，隨即進(jìn)入94℃變性40s、54℃退火40s、72℃延伸1min的循環(huán)，共進(jìn)行35次循環(huán)，最后72℃延伸10min，終止溫度4℃。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，對符合條件的PCR產(chǎn)物送北京百泰克生物技術(shù)有限公司，純化后進(jìn)行雙向測序，把測序所得序列在美國 http：／／www.ncbi.nlm.nib.gov的 Gen-Bank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST檢索分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 藤材接種變色菌后的顏色變化

研究從黃藤藍(lán)變、褐變、紅變等變色材中共計(jì)分離得到15種變色真菌，分別編號為F1～F15。從紅變材中共分離得到4種變色菌；從藍(lán)變材中共分離得到13種變色菌；褐變材與藍(lán)變材的分離情況大致相同。顏色均勻、單一的藤材變色，常為某一種變色菌所引起；藤材變色較為斑雜的，常可分離出多種變色菌。將15種變色菌分別接種到正常藤材上，接種2周后的藤材顏色變化如表1所示。表中，ΔL＊、Δa＊、Δb＊分別代表亮度指數(shù)L＊、藍(lán)綠指數(shù)a＊和黃紅指數(shù)b＊的差值；總色差ΔE＊代表總體顏色差異，ΔE＊＞3為可識別的顏色變化，ΔE＊＞6為顯而易見的顏色差異［11］。接種變色菌2周后，藤材發(fā)生了明顯的顏色變化，全部ΔE＊值都＞3；其中，有6種菌株使藤材ΔE＊值＞6，最大ΔE＊值達(dá)19.75，顏色變化極顯著。試驗(yàn)表明，變色菌對藤材的侵染較快，接種僅1周時(shí)藤材就發(fā)生了明顯的藍(lán)變、褐變及紅變等顏色變化。

圖1是分離頻次較高且對藤材顏色影響顯著的6種真菌分離前及接種后的藤材顏色。顏色比對表明，藤材接種變色菌后發(fā)生的變色，與變色菌分離藤材的顏色基本一致。結(jié)合變色菌的分離和培養(yǎng)性狀認(rèn)為，黃藤的藍(lán)變、褐變等真菌變色主要由真菌菌絲體顏色和其分泌色素被藤材組分吸收所致。

表1 黃藤材經(jīng)變色菌接種侵染2周后的顏色變化Table 1 Color changes of fungus-stained D.margaritae canes after 2weeks inoculation

2.2 藤材變色菌的形態(tài)學(xué)鑒定

通過對黃藤健全藤材進(jìn)行接種，選取對藤材顏色影響較大的6種主要變色菌F2、F6、F7、F9、F11和F15進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。黃藤材主要變色菌的形態(tài)學(xué)特征如圖2所示。

F2菌株：菌落圓形，粉末狀；菌株綠色，培養(yǎng)基茶褐色；營養(yǎng)菌絲有隔膜；分生孢子梗直立，多次分枝，小枝對生，頂端不膨大，排列成帚狀間枝，分生孢子串成不分枝的鏈狀，單個(gè)孢子球形、卵圓形，光滑，綠色，初步鑒定為青霉屬Penicillium真菌。

F6菌株：菌落初為白色，漸變?yōu)榛野字粱液谏詈笞兂珊谏?，菌落絨毛狀至棉絮狀，逐漸加厚成絨氈狀；菌落生長快，培養(yǎng)基藍(lán)黑色；菌絲種類單一，黑色、黑灰色或灰褐色，粗壯、長、多分枝、分隔明顯。偶見菌絲端頭鼓泡狀；在基內(nèi)菌絲中有大量粗壯的念珠狀菌絲；PDA培養(yǎng)2月未見產(chǎn)孢，初步鑒定為半知菌類真菌。

F7菌株：菌落圓形，生長較慢，絨狀，綠色，偶見黃褐色；菌株分泌物在菌落中心呈油滴狀聚集；培養(yǎng)基呈黃綠色或紫紅色，排列成同心輪紋；菌絲有隔膜，無色或淡色；分生孢子梗從壁厚而膨大的菌絲細(xì)胞生出，無隔膜，光滑，粗大，頂端膨大成半球形泡囊；從泡囊全部表面以放射狀生出小梗，頂端著生成串的球形分生孢子，初步鑒定為半知菌類曲霉屬Aspergillus真菌。

F9菌株：與F6菌株的形態(tài)特征和培養(yǎng)特性相似，但該菌株顏色較淺，為灰褐色，其PDA顏色也較淺，呈放射狀漸變；其基生菌絲產(chǎn)生的念珠更多更密集，初步鑒定為半知菌類真菌。F6和F9菌株的分離頻次高，各自培養(yǎng)性狀都較穩(wěn)定，都使黃藤材變色嚴(yán)重。

F11菌株：菌落圓形，粉末狀，分散生長，生長快，青綠色；培養(yǎng)基桔黃色或黃紅色；菌絲細(xì)長、分枝少，分隔，藍(lán)綠色；基內(nèi)菌絲密集，氣生菌絲稀少；2種菌絲均產(chǎn)孢；氣生菌絲幾乎都是分生孢子梗及分生孢子，梗側(cè)生，直立，一輪分枝，小枝對生，頂端不膨大，排列成帚狀間枝，分生孢子串成不分枝鏈狀，單個(gè)孢子球形、卵圓形，綠色，初步鑒定為青霉屬Penicillium真菌。

圖1 真菌分離前及接種后的藤材顏色Fig.1 Color comparison of fungi-isolated and fungi-inoculated canes

F15菌株：菌落圓形，絨毛狀，漸變成厚絨狀，生長快；菌絲白色，接種點(diǎn)周圍的菌絲漸變成紅色或紫紅色；培養(yǎng)基變紅色或紫紅色；菌絲長，分枝較多，有分隔；在較粗菌絲上分生多個(gè)短梗，其上著生大量分生孢子；孢子鐮刀形，具有3～5個(gè)隔膜；初步鑒定為鐮孢屬Fusarium真菌。

圖2 黃藤材變色菌的形態(tài)學(xué)特征Fig.2 Morphological characters of D.margaritae canes'stain fungi

2.3 藤材變色菌的分子生物學(xué)鑒定

將圖3中的ITS特征條帶切取回收并進(jìn)行克隆，克隆轉(zhuǎn)化測序后得到序列，遞交NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行核酸BLAST序列比對，結(jié)果見表2。從表2可看出，F(xiàn)2菌株與青霉菌Penicillium sumatrense同源性達(dá)99%；F6菌株與色二孢菌Botryodiplodia rhodina（=Lasiodiplodia theobromae）同源性達(dá)99%；F7菌株與薩氏曲霉Aspergillus sydowii同源性達(dá)99%；F9菌株與球二孢菌Botryodiplodia rhodina同源性達(dá)99%；F11菌株與青霉菌Penicillium sclerotiorum 同源性達(dá)97%；F15菌株與鐮刀菌Fusarium kyushuense同源性達(dá)97%。這與傳統(tǒng)形態(tài)鑒定方法所得鑒定結(jié)果相一致。

3 結(jié)論與討論

本研究分離出的黃藤材變色菌-青霉、曲霉、球色二孢菌與已報(bào)道藤材變色菌相似，另外還分離出了引起藤材紅變的鐮刀菌。真菌的形態(tài)鑒定和分子鑒定相輔相成。在實(shí)際工作中，形態(tài)鑒定是最方便、最常用的方法，某些特定菌種的分類須通過形態(tài)學(xué)表述，而分子生物學(xué)方法可使真菌分類更合理，更接近自然分類系統(tǒng)?；谛螒B(tài)學(xué)和分子生物學(xué)研究結(jié)果認(rèn)為，對黃藤材色影響較大的幾種變色菌，分別是薩氏曲霉A.sydowii、青霉菌P.sumatrense和P.sclerotiorum、色二孢菌L.theobromae、球二孢菌B.rhodina和鐮孢菌F.kyushuense。

圖3 黃藤材變色菌ITS序列的擴(kuò)增電泳圖Fig.3 PCR electrophoresis of ITS sequences of the stain fungi

表2 黃藤材變色菌的DNA序列BLAST比對結(jié)果Table 2 BLAST comparison results of DNA sequence of D.margaritae cane stained fungus

藤材變色菌的分離和鑒定，可為藤材真菌變色的防治提供重要的理論基礎(chǔ)和實(shí)際指導(dǎo)。本研究分離得到的黃藤材變色菌，從接種到藤材上的培養(yǎng)特性來看，變色菌的菌絲顏色或其所分泌的色素顏色，與分離變色菌的藤材變色大致相同，這表明變色菌在藤材上的生長性狀可能通過其在培養(yǎng)基上的生長性狀進(jìn)行表達(dá)。變色菌的菌絲顏色和其分泌的色素顏色是引起藤材變色的主要原因。通過對藤材進(jìn)行及時(shí)的藥劑處理，抑制相應(yīng)真菌生長，可有效防止黃藤材真菌變色。

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