李瑞杰，孫 倩，樊青霞

1.河南省胸科醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河南 鄭州450003;2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科

骨骼是許多惡性腫瘤常見的轉(zhuǎn)移部位。惡性腫瘤骨轉(zhuǎn)移常導(dǎo)致嚴(yán)重的骨骼病變，包括骨疼痛、病理性骨折、骨髓壓迫、高鈣血癥等骨相關(guān)事件(skeletal related event，SRE)［1］。雙膦酸鹽(bisphosphonates，BPs)是目前治療惡性腫瘤骨轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)用藥，可以抑制破骨細(xì)胞活性，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡，減少溶骨介質(zhì)的釋放，預(yù)防、減少或延遲骨相關(guān)事件的發(fā)生。最新研究結(jié)果顯示，BPs 對多種腫瘤具有直接抗腫瘤作用［2-4］。本實(shí)驗(yàn)將以食管鱗癌細(xì)胞株EC9706 為研究對象，了解BPs對食管癌細(xì)胞增殖及VEGF 表達(dá)的影響，探討伊班膦酸鈉對VEGF 表達(dá)的作用。

1 材料與方法

1.1 材料及細(xì)胞株 人食管鱗癌細(xì)胞株EC9706 由鄭州大學(xué)腫瘤中心實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)予，伊班膦酸鈉(河北醫(yī)科大學(xué)制藥廠)，RPMI1640 培養(yǎng)液(GIBCO 公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，MTT(美國Sigma 公司)，免疫組化SP 通用試劑盒、VEGF一抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，CO2孵箱(HERAEUS 公司)，96 孔板(COSTOR 公司);酶標(biāo)儀(美國Bio-RAD 公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 食管鱗癌細(xì)胞株EC9706 在含10%的胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)液中培養(yǎng)，其內(nèi)加入青霉素(100 μmol/L)、鏈霉素(100 μmol/L)，置于5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，0.25%胰酶消化傳代。1.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 取對數(shù)生長期的EC9706 細(xì)胞，加入0.25%的胰酶和0.02%EDTA 消化后，吹打成單細(xì)胞懸液，接種于100 ml 培養(yǎng)瓶中，24 h 換液，加入伊班膦酸鈉使其終濃度分別為5、10、20、40 μg/ml，設(shè)不加藥的陰性對照組。置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，培養(yǎng)48 h 在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況。

1.4 MTT 法測定伊班膦酸鈉對EC9706 增殖的影響培養(yǎng)EC9706 細(xì)胞在96 孔板中，待細(xì)胞貼壁后加入伊班膦酸鈉，設(shè)5、10、20、40 μg/ml 4 個(gè)濃度，每個(gè)濃度設(shè)5 個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)調(diào)零孔(僅培養(yǎng)液)和對照孔(未加藥)，分別于24、48、72 h 時(shí)終止培養(yǎng)，每孔加入20 μl MTT 溶液，作用4 h 后棄去培養(yǎng)液，每孔加入150 μl 二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，在酶標(biāo)儀OD 492 nm 處測量各孔的吸光值。按下面公式計(jì)算不同濃度的伊班膦酸鈉對食管癌EC9706 細(xì)胞增殖的抑制率，每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3 次。細(xì)胞生長抑制率(%)= (1 - 實(shí)驗(yàn)孔平均OD 值/對照孔平均OD 值)×100%。

1.5 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測伊班膦酸鈉對EC 9706 細(xì)胞VEGF 表達(dá)的影響 按4 ×104/ml 的密度將EC-9706 細(xì)胞接種到放有蓋玻片的24 孔板內(nèi)，1 ml/孔。加入不同濃度伊班膦酸鈉(10、20、40 μg/ml)的RPMI1640 培養(yǎng)液，對照組加入不含伊班膦酸鈉的RPMI1640 培養(yǎng)液。一抗4 ℃過夜。次日復(fù)溫、洗滌后滴加二抗。在辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液37 ℃孵育30 min，DAB 染色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核。結(jié)果判定:VEGF 的陽性顆粒呈棕黃色，主要分布在細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，部分細(xì)胞膜同時(shí)表達(dá);每張蓋玻片中隨機(jī)選擇10 個(gè)視野，每視野計(jì)數(shù)100 個(gè)腫瘤細(xì)胞中VEGF 染色陽性的細(xì)胞數(shù)，將10 個(gè)視野的平均陽性數(shù)作為每1 例的陽性數(shù)，用百分?jǐn)?shù)表示。對照組設(shè)計(jì):以PBS 代替一抗作陰性對照，結(jié)果陰性;陽性對照:試劑公司提供的陽性切片作為陽性對照，結(jié)果陽性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以s 表示，采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)變化 倒置顯微鏡下觀察:對照組EC9706 細(xì)胞生長密集，貼壁良好，相互連接成片，細(xì)胞呈現(xiàn)多角形，呈現(xiàn)鋪路石外觀，胞漿透亮，折光性好。實(shí)驗(yàn)組隨著伊班膦酸鈉藥物濃度增加和作用時(shí)間延長，部分細(xì)胞體積變圓、縮小，細(xì)胞碎片增多，核染色質(zhì)和胞漿皺縮，胞膜和核膜增厚，折光性差，細(xì)胞貼壁能力下降(見圖1)。

2.2 伊班膦酸鈉對食管癌EC9706 細(xì)胞增殖的影響不同藥物濃度(5、10、20、40 μg/ml)的伊班膦酸鈉對EC9706 細(xì)胞均有抑制作用，隨時(shí)間和藥物濃度的增加，其抑制增殖作用越來越強(qiáng)，與對照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05，見表1、圖2)。

2.3 伊班膦酸鈉對食管癌EC9706 細(xì)胞VEGF 蛋白

表達(dá)的影響 隨著藥物濃度的增加，VEGF 的表達(dá)呈降低趨勢。對照組及10、20、40 μg/ml 濃度VEGF 蛋白的表達(dá)率分別為43.81 ±3.61、30.92 ±3.30、21.57±3.17、9.05 ±1.38;單因素方差分析顯示，不同濃度伊班膦酸鈉作用下EC9706 細(xì)胞VEGF 的表達(dá)有顯著性差異(F=240.123，P=0.000)，組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

圖1 伊班膦酸鈉作用后EC9706 細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化(400×) A:對照組;B:5 μg/ml 組;C:10 μg/ml 組;D:20 μg/ml 組;E:40 μg/ml 組Fig 1 Morphological changes of EC9706 cells treated by ibandronate (400 ×) A:control group;B:5 μg/ml group;C:10 μg/ml group;D:20 μg/ml group;E:40 μg/ml group

表1 伊班膦酸鈉對EC9706 細(xì)胞增殖的影響Tab 1 Effects of ibandronate on the proliferation of EC9706 cells

圖2 伊班膦酸鈉對EC9706 細(xì)胞增殖的影響Fig 2 Effects of ibandronate on the proliferation of EC9706 cells

3 討論

BPs 是內(nèi)源性焦磷酸鹽的同分異構(gòu)體，具有強(qiáng)大的抗骨吸收功能，越來越多實(shí)驗(yàn)表明BPs 對多種腫瘤具有直接抗腫瘤作用。增殖失控是腫瘤細(xì)胞的主要生物學(xué)特征。本研究首先采用MTT 法研究伊班膦酸鈉對食管癌EC9706 細(xì)胞增殖的影響:可以明顯抑制EC9706 細(xì)胞的增殖，且抑制作用具有時(shí)間和劑量依賴性。這與戴廣海等［2-3］的研究結(jié)果一致。何賢峰等［4］研究顯示，唑來膦酸對骨肉瘤LM8 細(xì)胞有明顯增殖抑制作用，并呈濃度依賴性。

腫瘤血管生成是腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素。在血管生成的調(diào)控因素中，VEGF 是已知最強(qiáng)的內(nèi)源性血管生成促進(jìn)因子。多個(gè)研究結(jié)果證實(shí)BPs 可以抑制血管形成。Fournier 等［5］發(fā)現(xiàn)，唑來膦酸體外可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，抑制毛細(xì)血管樣管腔形成;唑來膦酸和伊班膦酸體內(nèi)可以抑制睪酮誘導(dǎo)血管生成的作用，影響去勢小鼠前列腺癌的血管重建。Wood 等［6］的研究顯示唑來膦酸可以抑制胎牛血清、bFGF、VEGF 誘導(dǎo)的人臍靜脈上皮細(xì)胞的增殖。

本研究應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測伊班膦酸對食管癌EC9706 細(xì)胞VEGF 表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，隨著藥物濃度的增加，VEGF 的表達(dá)呈降低趨勢。這與劉家國等［7］的研究結(jié)果一致:唑來膦酸是通過抑制骨肉瘤細(xì)胞VEGF 表達(dá)和分泌，抑制腫瘤新生血管的形成，抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。

本研究證實(shí)伊班膦酸可以抑制食管癌細(xì)胞的增殖，但是所需濃度高，需要作用較長時(shí)間，而抑制VEGF 表達(dá)作用迅速，且低濃度的伊班膦酸就可以顯著抑制VEGF 的表達(dá)。BPs 單純作為細(xì)胞毒藥物應(yīng)用于腫瘤治療，可行性不大，但是作為輔助藥物與傳統(tǒng)細(xì)胞毒藥物聯(lián)用，通過其抑制腫瘤血管生成作用來增強(qiáng)細(xì)胞毒藥物的抗腫瘤活性，這可能是BPs 用于腫瘤治療的新出路。

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