林建華，陳 聰，林壽榕，胡 冰，李雪婷，蔡紹環(huán)，何玉賢，徐志峰

1.南京軍區(qū)福州總醫(yī)院九五臨床部胸外科，福建 莆田351100;2.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科;3.福建醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)系

福建省是全國胃癌高發(fā)區(qū)之一，胃癌標(biāo)化死亡率為37.72/10 萬，某些地區(qū)胃癌標(biāo)化死亡率高達(dá)50/10萬～100/10 萬。早期胃癌診斷率仍較低，大多數(shù)胃癌患者就診時腫瘤已處于進(jìn)展期，這是我省乃至全國胃癌死亡率居高不下的重要原因之一。另外，胃癌起病隱匿、臨床表現(xiàn)缺乏特征性，給早期診斷造成困難。

腺泡細(xì)胞在癌變的過程中伴有基因異常和一些標(biāo)記性蛋白的異常表達(dá)。先前大量文獻(xiàn)報道［1-2］CDK 基因突變與胃癌發(fā)病密切相關(guān)，但是突變型CDK 基因在外周血中含量極低，通常局限于癌組織，這就意味著如果患者要通過CDK 基因檢測實(shí)現(xiàn)早期診斷就得進(jìn)行內(nèi)鏡取材，這顯然是無法用于大規(guī)模的普查。最近研究表明胰蛋白酶可通過降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜參與胃癌的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移過程，影響著胃癌的發(fā)生、發(fā)展和臨床轉(zhuǎn)歸。因此，研究胃癌患者的血清胰蛋白酶-抗胰蛋白酶的失衡情況將為胃癌的診斷尋找新的標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2009 年6 月-2013 年12 月經(jīng)病理證實(shí)的胃癌患者25 例，男18 例，女7 例，年齡52～77 歲，平均年齡(62.3 ±14.6)歲。采取血標(biāo)本進(jìn)行基因測序和血清學(xué)分析前均取得患者及家屬的同意。另取62 名與患者無親緣關(guān)系的健康體檢者為對照組，男42 名，女20 名，年齡46 ～81 歲，平均年齡(61.5 ±15.8)歲。

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取:知情同意的情況下，應(yīng)用Tiangen全血DNA 提取試劑盒從患者EDTA 抗凝外周血中抽取DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?，按照DNA 提取試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.2 PCR 引物及PCR 反應(yīng):依據(jù)參考文獻(xiàn)［2］設(shè)計引物并進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。

1.2.3 PCR 產(chǎn)物純化和回收:使用Tiangen 公司膠回收試劑盒，按使用說明操作，回收產(chǎn)物。

1.2.4 測序:PCR 產(chǎn)物直接測序由上海博尚生物技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

1.2.5 血清胰蛋白酶和抗胰蛋白酶水平的檢測:應(yīng)用ELISA 試劑盒檢測胃癌患者及健康對照者的血清胰蛋白酶和抗胰蛋白酶水平。

1.2.6 組織病理學(xué)分析:取患者的胃癌、癌旁和遠(yuǎn)離癌的正常組織做CDK 免疫組織化學(xué)染色，分析CDK表達(dá)的情況和組織病理學(xué)特征。

1.2.7 臨床資料收集:記錄患者的其他臨床資料(年齡、性別、發(fā)病年齡、病程、家族史、并發(fā)癥及治療情況)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以x ±s 表示，組間比較采用t 檢驗(yàn)，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 表型診斷 25 例胃癌患者中共檢測到5 例存在CDK4 基因突變。5 例患者的血清胰蛋白酶和彈力蛋白酶顯著增高，纖維化指標(biāo):透明質(zhì)酸、Ⅳ型膠原、層黏連蛋白和Ⅲ型前膠原N 端肽均顯著增高(見表1)。

表1 5 例CDK4 基因突變患者的基本資料Tab 1 The basic data of five patients with CDK4 gene mutation

2.2 CDK4 基因測序結(jié)果 在5 例胃癌患者中發(fā)現(xiàn)CDK4 基因3 號外顯子存在c.110 T ＞A 突變，突變造成p.M37T 改變。使非極性的甲硫氨酸被極性蘇氨酸所取代(見圖1)，這種突變形式均不存在于正常對照組和患者家系內(nèi)的其他健康成員中。

2.3 血清胰蛋白酶濃度在胃癌組和正常對照組中的比較 胃癌組患者血清胰蛋白酶的平均濃度為正常對照組的2.05 倍，且攜帶CDK4 基因突變的胃癌患者血清胰蛋白酶平均濃度顯著高于其他胃癌患者(P ＜0.05，見圖2)，而血清抗胰蛋白酶濃度胃癌組(1.23 ±0.32)g/L 與正常對照組(1.09 ±0.29)g/L 相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)。

2.4 組織病理學(xué)分析 腺泡萎縮，中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤，胃癌組織CDK4 呈強(qiáng)陽性表達(dá)，其陽性率為76%，而癌旁僅8%表達(dá)強(qiáng)陽性;而在弱表達(dá)中，癌組織顯著高于癌旁組織(見圖3)。

圖1 CDK4 基因c.110 T ＞A 突變形式的測序圖 A ～B:患者的CDK4 基因c.110 T ＞A 雜合突變測序結(jié)果;C:正常對照組的測序結(jié)果Fig 1 CDK4 gene c.110 T ＞A mutation A ～B:patients with CDK4 gene c. 110 T ＞A heterozygous mutation;C:normal control group

圖2 各組血清胰蛋白酶濃度的比較Fig 2 Comparison of serum trypsin concentrations in each group

圖3 CDK4 表達(dá)情況 A:CDK4 在癌組織和癌旁組織中的陽性表達(dá);B:強(qiáng)陽性表達(dá)(400 ×);C:弱陽性表達(dá)(400 ×)Fig 3 Expression of CDK4 A:positive expression of CDK4 in carcinoma tissues and adjacent tissues;B:expression of strong positive (400 ×);C:expression of weak positive (400 ×)

3 討論

胰蛋白酶原的異常激活引起其他酶原的活化受阻或活化過度(酶-抗酶的失衡)，將導(dǎo)致機(jī)體局部甚至多系統(tǒng)的炎癥損傷，從而破壞細(xì)胞微環(huán)境，k-ras 等基因突變形成早期的腫瘤細(xì)胞;隨后，胰蛋白酶作為信號因子促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和破壞基質(zhì)促進(jìn)轉(zhuǎn)移［3-5］，同時胰蛋白酶還可以作為淋巴細(xì)胞的刺激源協(xié)同α1抗胰蛋白酶(α1-AT)在突變細(xì)胞的免疫耐受中起重要作用，這個過程也授予細(xì)胞優(yōu)勢選擇，使它們在腫瘤細(xì)胞群中成為顯性，通過克隆選擇，腫瘤變得快速生長并增加惡性表型。

胃癌是消化道常見惡性腫瘤，發(fā)病率、死亡率均較高。隨著基因組計劃的完成，越來越多疾病的致病基因被揭示，部分疾病還將通過基因治療而治愈?，F(xiàn)在已確切地認(rèn)為腫瘤是一種多基因病變，惡性腫瘤細(xì)胞的特點(diǎn)之一是細(xì)胞失腔性生長，在基因水平上則表現(xiàn)為抑癌基因的失活和癌基因的激活以及細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因表達(dá)的紊亂［6-8］。

人類12 號染色體長臂存在一些與腫瘤相關(guān)基因，目前在這一區(qū)域中已發(fā)現(xiàn)超過5 個與骨肉瘤等實(shí)體瘤相關(guān)基因如CDK2、CDK4、WNT1、MDM2 和WNT10b。CDK4 基因由303 個氨基酸組成，分子量大約為33.7 kD，是Ser-Thr 蛋白激酶種屬，它催化作用的區(qū)域從第6 個氨基酸延伸到第295 個。在同一細(xì)胞和組織中，CDK4 的表達(dá)是多樣的，同樣多樣性存在于腫瘤細(xì)胞中［7-9］。

細(xì)胞的正常生長依賴于細(xì)胞周期中各種調(diào)節(jié)因子的平衡調(diào)控，其中包括細(xì)胞周期素D1(Cyclin d1)對細(xì)胞生長的正性調(diào)控及周期素依賴性激酶(CDK4)抑制子(p16)對細(xì)胞生長的負(fù)性調(diào)控。調(diào)控環(huán)路中任一調(diào)節(jié)因子發(fā)生紊亂都將導(dǎo)致細(xì)胞增殖異常，誘發(fā)腫瘤。在家族性黑色素瘤中p16 INK4a 結(jié)合域的CDK4 發(fā)生胚突變［5］。p16 是新近分離出來的抑癌基因，p16 功能喪失或Cyclin d1 過度表達(dá)都會導(dǎo)致CDK4 對視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤易感因子(Rb)的調(diào)節(jié)障礙，使Rb 處于持續(xù)磷酸化狀態(tài)，釋放大量生長調(diào)節(jié)因子E2F，細(xì)胞過度增殖誘發(fā)腫瘤。本研究在胃癌患者中發(fā)現(xiàn)CDK4 基因3 號外顯子存在高頻突變，而且CDK4 在癌組織的表達(dá)顯著高于癌旁組織，說明CDK4 在細(xì)胞周期的調(diào)控中起關(guān)鍵作用。

長期以來，國內(nèi)外的腫瘤研究者均將單一的腫瘤標(biāo)志物作為尋找目標(biāo)，而忽視了造就腫瘤的微環(huán)境紊亂，而胃是人體重要的消化和內(nèi)分泌器官，其通過旁分泌、自分泌等形式產(chǎn)生了大量的消化酶，其中酶原的異常活化與酶和抗酶的“博弈”造就其獨(dú)特的微環(huán)境值得深入研究。胰蛋白酶原一旦被激活，各種酶前體就會逐步激活，導(dǎo)致迅速不可逆的特異性細(xì)胞應(yīng)答，因此，胰蛋白酶對維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定有著重要作用，生理狀態(tài)下，機(jī)體內(nèi)的絲氨酸蛋白酶抑制劑(serine protease inhibitor Kazal-type 1，SPINK1)(20%)和α1-AT(約80%)可對抗胰蛋白酶的活性，但是過量的α1-AT 又可導(dǎo)致突變細(xì)胞的免疫耐受［10-13］。因此，有必要分析胰蛋白酶-抗胰蛋白酶平衡點(diǎn)與胃癌發(fā)生、侵襲和臨床轉(zhuǎn)歸的內(nèi)在聯(lián)系。目前還沒有針對胰蛋白酶-抗胰蛋白酶失衡引發(fā)胃癌的系統(tǒng)性研究報道。

本研究發(fā)現(xiàn)，胃癌患者的血清胰蛋白酶水平是正常對照組的2.05 倍，而抗胰蛋白酶水平與正常對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，這樣就造成胰蛋白酶-抗胰蛋白酶水平的失衡。胰蛋白酶可通過降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜參與胃癌的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移過程［3，14］。因此，血清胰蛋白酶異常升高是胃癌的危險信號，其誘導(dǎo)細(xì)胞癌變的原理:胰蛋白酶激活細(xì)胞膜表面的蛋白酶活化受體-2(proteinase activated receptor-2，PAR-2)后促進(jìn)了p-ERKI/2 的形成，導(dǎo)致p-ERK 入核增多，使其下游因子c-fos 的表達(dá)增加，進(jìn)而促進(jìn)c-fos 和c-jun 二聚化形成AP-1，AP-1 通過與PCNA 基因上的AP-1 位點(diǎn)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控下游靶基因PCNA 的mRNA轉(zhuǎn)錄，從而影響PCNA 蛋白的合成，引起致癌作用［14］。也印證了:α1-AT 代償性增加是機(jī)體為了中和和抑制胰蛋白酶等蛋白水解酶活性抑制細(xì)胞增殖阻止腫瘤擴(kuò)散的理論［3，14］?？梢娨鹊鞍酌傅漠惓Ｍㄟ^胰蛋白酶—PAR-2 信號激活途徑在胃癌發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移中起到重要作用［11-14］。

本研究從“酶-抗酶失衡”新視角，闡述胃癌細(xì)胞免疫耐受與克隆增生的關(guān)系，有助于進(jìn)一步明確腫瘤微環(huán)境的變化及胃癌發(fā)生的免疫機(jī)制，有可能為胃癌的早期發(fā)現(xiàn)與診斷提供敏感特異的標(biāo)志物，同時胃癌患者中發(fā)現(xiàn)CDK4 基因突變及其表達(dá)異常也為胃癌的治療和基因治療提供新的靶點(diǎn)。

［1］ Khatib ZA，Matsushime H，Valentine M，et al. Coamplification of the CDK4 gene with MDM2 and GLI in human sarcomas［J］. Cancer Res，1993，53(22):5535-5541.

［2］ Gao F，Li Y，Wang C，et al. Identification of a novel frame-shift mutation in PRSS1 gene in Han patients with autoimmune pancreatitis［J］.Curr Mol Med，2014，14(3):340-348.

［3］ Chen QQ，Gao F，Zhuang ZH，et al. Trypsin-antitrypsin imbalance in immune escape and clonal proliferation of pancreatic cancer ［J］. J Genet Syndr Gene Ther，2013，4(11):11-15.

［4］ Gao F，Li YM，Hong GL，et al. PRSS1_p.Leu81Met mutation results in autoimmune pancreatitis ［J］. World J Gastroenterol，2013，19(21):3332-3338.

［5］ Liu Q，Lin X，Liu J，et al. The -409 C/T genotype of PRSS1 protects against pancreatic cancer in the Han Chinese population［J］. Dig Dis Sci，2012，57(2):573-579.

［6］ Gaber A，Nodin B，Hotakainen K，et al. Increased serum levels of tumour-associated trypsin inhibitor independently predict a poor prognosis in colorectal cancer patients［J］. BMC Cancer，2010，10:498.

［7］ Malumbres M，Barbacid M. Mammalian cyclin-dependent kinases ［J］.Trends Biochem Sci，2005，30(11):630-641.

［8］ Reddy HK，Mettus RV，Rane SG，et al. Cyclin-dependent kinase 4 expression is essential for neu-induced breast tumorigenesis［J］. Cancer Res，2005，65(22):10174-10178.

［9］ Gao F，Liu QC，Wang M，et al. Novel mutation of the cyclin-dependent kinase 4 gene in a Chinese patient with intimal sarcoma of the pulmonary artery［J］. Chin Med J (Engl)，2009，122(9):1107-1109.

［10］ Itkonen O. Human trypsinogens in the pancreas and in cancer［J］.Scand J Clin Lab Inves，2010，70(2):136-143.

［11］ Koskensalo S，Hagstr?m J，Louhimo J，et al. Tumour-associated trypsin inhibitor TATI is a prognostic marker in colorectal cancer［J］.Oncology，2012，82(4):234-241.

［12］ Tawara I，Sun Y，Lewis EC，et al. Alpha-1-antitrypsin monotherapy reduces graft-versus-host disease after experimental allogeneic bone marrow transplantation［J］. Proc Natl Acad Sci U S A，2012，109(2):564-569.

［13］ Cenac N，Cellars L，Steinhoff M，et al. Proteinase-activated receptor-1 is an anti-inflammatory signal for colitis mediated by a type 2 immune response［J］. Inflamm Bowel Dis，2005，11(9):792-798.

［14］ Kereszturi E，Sahin-Tóth M. Intracellular autoactivation of human cationic trypsinogen mutants causes reduced trypsinogen secretion and acinar cell death［J］. J Biol Chem，2009，284(48):33392-33399.