殷漢華，何雅軍，韓馥縵，呂 霞，付 景，周文杰，舒建昌

1.廣東省河源市中醫(yī)院內(nèi)三區(qū)，廣東 河源517000;2.暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬?gòu)V州紅十字會(huì)醫(yī)院消化科

肝纖維化是各種慢性肝病發(fā)展至肝硬化的必經(jīng)途徑，由多種因素所致的外界刺激引起各種細(xì)胞因子的釋放，細(xì)胞因子-細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)間相互作用，最終使大量ECM 沉積于肝臟形成肝纖維化。其中，肝星狀細(xì)胞(HSC)活化增殖，合成分泌各種細(xì)胞因子及細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路蛋白，產(chǎn)生大量以膠原為主的ECM 成分，且合成多于降解，造成ECM 在肝內(nèi)沉積，是肝纖維化形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。姜黃素是中藥姜黃的提取物，具有明確的抗纖維化作用。本研究旨在觀察姜黃素對(duì)人HSC 株LX-2 中NGF 及其受體P75NTR表達(dá)的影響，從而探討NGF 及P75NTR在姜黃素抗肝纖維化機(jī)制中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝星狀細(xì)胞株LX-2，由美國(guó)Mount Sinai 醫(yī)學(xué)院的Scott L. Friedman 教授饋贈(zèng);MTT、姜黃素、DMSO 購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司;DMEM 培養(yǎng)基干粉為美國(guó)Gibco 公司生產(chǎn);胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司;兔抗神經(jīng)生長(zhǎng)因子多克隆抗體購(gòu)自北京博奧森生物工程有限公司;兔抗P75NTR多克隆抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的復(fù)蘇與培養(yǎng):LX-2 于37 ℃快速?gòu)?fù)蘇，接種于塑料培養(yǎng)瓶中，采用10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2及飽和濕度下培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至80% ～90%密度時(shí)，用0.02% EDTA 和0.25%胰蛋白酶消化，以1∶4 傳代。

1.2.2 姜黃素對(duì)人HSC 增殖的影響:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2.0 ×105個(gè)/ml，細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μl，24 h 后加入無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞同步化于休止期，棄上清，加入含不同濃度姜黃素(0、10、20、30、40、50、60、70、80 μmol/L)的DMEM 培養(yǎng)液，每組設(shè)4 個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后，棄上清，每孔加入200 μl 培養(yǎng)液和50 μl 現(xiàn)配的MTT 比色液，置培養(yǎng)箱中孵育4 h，去除培養(yǎng)液，加入150 μl DMSO 振蕩溶解，酶標(biāo)儀以參考波長(zhǎng)630 nm、測(cè)量波長(zhǎng)570 nm 測(cè)定吸光值。

1.2.3 細(xì)胞爬片的制備:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以1.5×105/ml 密度滴加于提前處理好的置于六孔板內(nèi)的蓋玻片上，每孔滴加0.4 ml 細(xì)胞懸液，24 h 后加入無(wú)血清DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞同步化于休止期，棄上清，分別加入含40 μmol/L 姜黃素以及正常的培養(yǎng)液，再培養(yǎng)24 h 后，棄上清，每孔加入4 ml PBS 洗滌玻片10 min×3 次，加入4%多聚甲醛2 ml 固定30 min，棄去固定液，每孔再加入4 ml 蒸餾水洗滌玻片10 min×3 次，撈出玻片置于玻片架，通風(fēng)櫥中至完全干燥，于-20℃冰箱保存待用。

1.2.4 細(xì)胞免疫化學(xué)染色:蒸餾水洗細(xì)胞爬片3 min×3 次;切片于0.01 mol/L 檸檬酸緩沖液中微波煮沸修復(fù)10 min，常溫冷卻，蒸餾水洗3 min ×3 次;0.3%H2O2甲醇液室溫浸泡10 min，以滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，PBS 洗3 min ×3 次;加正常山羊血清室溫封閉20 min，以封閉非特異性抗原;棄去多余血清，分別滴加人鼠通用型兔抗NGF 多抗(1∶200 稀釋)和人鼠通用型兔抗P75NTR多抗(1∶150 稀釋)，濕盒內(nèi)4 ℃過(guò)夜;次晨室溫箱孵育30 min，PBS 洗5 min ×3 次，滴加生物素化山羊抗兔IgG，于濕盒內(nèi)室溫孵育10 min，PBS 洗3 min×3 次，滴加50 μl 鏈霉菌抗生物素-過(guò)氧化物酶溶液，濕盒內(nèi)室溫下10 min，PBS 洗3 min ×3 次，DAB顯色，鏡下控制顯色時(shí)間，流水沖洗終止，蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精稍分化，脫水透明，中性樹(shù)脂封片，光鏡下觀察，陽(yáng)性細(xì)胞為胞膜或胞漿呈棕黃色。以PBS 代替一抗作為陰性對(duì)照。結(jié)果判斷:于200 ×光學(xué)顯微鏡視野下計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比例，每張切片計(jì)數(shù)5 個(gè)視野。以陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)代表各個(gè)蛋白表達(dá)陽(yáng)性率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)采用x-±s 表示，多組數(shù)據(jù)間的比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，若各組總體方差齊同，采用Tukey(分組＞5)檢驗(yàn)或Bonferroni(分組＜5)檢驗(yàn);若各組總體方差不齊同，采用Tamhane's T2 檢驗(yàn)。P ＜0. 05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素對(duì)HSC 增殖的影響 不同濃度姜黃素與HSC 作用24 h 后，各組檢測(cè)的吸光值如表1 所示。在30 ～80 μmol/L 濃度范圍內(nèi)，隨著姜黃素劑量的增加，LX-2 的吸光值呈斜行直線下降(見(jiàn)圖1)。

2.2 姜黃素對(duì)NGF 蛋白表達(dá)的影響 NGF 主要在胞漿及胞膜表達(dá)(見(jiàn)圖2)?？瞻讓?duì)照組中陽(yáng)性表達(dá)率為(27.11 ±5.50)%，姜黃素作用于LX-2 后NGF 表達(dá)均有不同程度的升高，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0. 01)，其中以40 μmol/L 時(shí)表達(dá)率為最高(90.75 ±4.72)%(見(jiàn)表2)。

2.3 姜黃素對(duì)P75NTR蛋白表達(dá)的影響 P75NTR表達(dá)于胞漿及胞膜(見(jiàn)圖3)，空白對(duì)照組中陽(yáng)性表達(dá)率為(24.33 ±5.17)%，不同濃度姜黃素作用于LX-2 后表達(dá)率均升高，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，其中以40 μmol/L 時(shí)表達(dá)率為最高(88.74 ±6.27)%(見(jiàn)表2)。

表1 不同濃度姜黃素對(duì)HSC 增殖的影響Tab 1 The effect of different concentration of curcumin on HSC proliferation

表2 姜黃素作用HSC 后NGF、P75NTR 表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞率(%)Tab 2 Effect of curcumin on expression of NGF and P75NTR of HSC (%)

3 討論

姜黃素是從姜科姜黃屬(Curcuma L1)植物姜黃、莪術(shù)、郁金等根莖中提取的一種天然酚類(lèi)，被廣泛用作色素、食品添加劑及調(diào)味品等，具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、清除氧自由基以及對(duì)腎臟的保護(hù)、幫助肌肉損傷修復(fù)等多方面藥理作用，既往多用于抗腫瘤研究中，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)姜黃素具有良好的抗肝纖維化作用。

圖1 MTT 法檢測(cè)姜黃素對(duì)HSC 增殖的影響Fig 1 Effect of curcumin on HSC proliferation detected by MTT

圖2 NGF 免疫細(xì)胞化學(xué)染色(200 ×) A:空白對(duì)照組;B:40 μmol/L 姜黃素組;圖3 P75NTR免疫細(xì)胞化學(xué)染色(200 ×) A:空白對(duì)照組;B:40 μmol/L 姜黃素組Fig 2 Immunocytochemistry staining of NGF (200 ×) A:normal control group;B:40 μmol/L curcumin group;Fig 3 Immunocytochemistry staining of P75NTR(200 ×) A:normal control group;B:40 μmol/L curcumin group

我們研究小組既往的研究已分別在細(xì)胞和大鼠活體水平證實(shí)，姜黃素具有抗肝纖維化的作用，與其抑制HSC 增殖、誘導(dǎo)HSC 凋亡、抗脂質(zhì)過(guò)氧化等機(jī)制有關(guān)［1-4］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:一定濃度姜黃素(10 ～80 μmol/L)作用于人HSC 株LX-2 后，可使人HSC 的增殖明顯減少，且呈劑量依賴(lài)性，與上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

NGF 屬于神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族，最早在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)發(fā)現(xiàn)，通過(guò)與低親和力受體P75NTR和高親和力酪氨酸激酶受體TrkA 結(jié)合發(fā)揮多種生物學(xué)作用，在神經(jīng)系統(tǒng)的生長(zhǎng)、分化、發(fā)育、再生與修復(fù)過(guò)程中意義重大。近期研究發(fā)現(xiàn)NGF 具有影響局部細(xì)胞的分化、增殖、遷移、凋亡和組織重建等作用［5-7］。對(duì)正常小鼠和部分肝切除小鼠的再生肝組織進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)再生肝組織中NGF 和P75NTR的mRNA 表達(dá)量高于正常肝組織;進(jìn)一步分離肝細(xì)胞和HSC 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，正常肝細(xì)胞中無(wú)NGF 和P75NTR表達(dá)，再生肝細(xì)胞中僅可檢測(cè)到NGF;未活化的HSC 內(nèi)僅能檢測(cè)到少量NGF 和P75NTR表達(dá)，活化后兩者表達(dá)量均明顯升高［8］;在纖溶酶原缺乏的自發(fā)肝病小鼠模型中發(fā)現(xiàn)肝組織內(nèi)P75NTR蛋白僅表達(dá)于HSC 中，且模型組表達(dá)較正常小鼠明顯增加［9］;大鼠肝纖維化模型造模24 h 后NGF 表達(dá)量迅速上調(diào)，于48 h、72 h 后迅速下降，96 h 不再高表達(dá)，而P75NTR在肝纖維化過(guò)程中始終有表達(dá)［10-11］。野生型小鼠肝組織中HSC 凋亡率在無(wú)外源NGF 刺激時(shí)與P75NTR基因敲除小鼠無(wú)差異，但給予外源性NGF 后其凋亡率明顯增加，而基因敲除小鼠中凋亡率無(wú)明顯變化［9］，提示NGF 必須與P75NTR結(jié)合才能促進(jìn)HSC 凋亡。NGF可能通過(guò)P75NTR參與誘導(dǎo)HSC 凋亡而發(fā)揮抗肝纖維化作用，具體機(jī)制尚未明確。

本實(shí)驗(yàn)采用體外培養(yǎng)人HSC 株LX-2 并給予不同濃度的姜黃素處理，對(duì)比觀察各組HSC 中NGF、P75NTR表達(dá)量的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)NGF 和P75NTR蛋白表達(dá)在姜黃素處理后均有明顯增加，與空白對(duì)照組比較，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示姜黃素可誘導(dǎo)HSC 表達(dá)NGF、P75NTR蛋白，該作用可能是姜黃素發(fā)揮抗肝纖維化作用的機(jī)制之一。而姜黃素具體通過(guò)哪些途徑影響NGF 和P75NTR蛋白表達(dá)尚不清楚，有待進(jìn)一步研究探討。

［1］ Shu JC，He YJ，Lv X，et al. Effect of curcumin on the proliferation and apoptosis of hepatic stellate cells ［J］. Braz J Med Biol Res，2009，42(12):1173-1178.

［2］ Shu JC，He YJ，Lv X，et al. Curcumin prevents liver fibrosis by inducing apoptosis and suppressing activation of hepatic stellate cells［J］. J Nat Med，2009，63(4):415-420.

［3］ Shu JC，Ye GR，Lv X，et al. Therapeutic effects of curcumin treatment on hepatic fibrosis ［J］. Chin J Hepatol，2007，15(10):753-757.舒建昌，葉國(guó)榮，呂霞，等. 姜黃素治療肝纖維化及其作用機(jī)制的初步研究［J］. 中華肝臟病雜志，2007，15(10):753-757.

［4］ Lv X，Shu JC，F(xiàn)u J，et al. Effects of curcumin on the expressions of leptin and adiponectin in human stellate cell strain LX-2［J］. Guangdong Medical Journal，2013，34(11):1641-1644.呂霞，舒建昌，付景，等. 姜黃素對(duì)人肝星狀細(xì)胞株LX-2 瘦素和脂聯(lián)素表達(dá)的影響［J］. 廣東醫(yī)學(xué)，2013，34(11):1641-1644.

［5］ Peters EM，Raap U，Welker P，et al. Neurotrophins act as neuroendocrine regulators of skin homeostasis in health and disease［J］. Horm Metab Res，2007，39(2):110-124.

［6］ Li JF，Shu JC，Chen LX，et al. Nerve growth factor promotes proliferation of hepatocytes in vitro via TrkANGFRsignal pathway［J］. Chinese Journal of Pathophysiology，2012，28(2):320-325.李俊峰，舒建昌，陳蓮香，等. 神經(jīng)生長(zhǎng)因子通過(guò)TrkANGFR信號(hào)途徑促進(jìn)肝細(xì)胞增殖［J］. 中國(guó)病理生理雜志，2012，28(2):320-325.

［7］ Ratto MH，Leduc YA，Valderrama XP，et al. The nerve of ovulationinducing factor in semen［J］. Proc Natl Acad Sci U S A，2012，109(37):15042-15047.

［8］ Asai K，Tamakawa S，Yamamoto M，et al. Activated hepatic stellate cells over-express p75NTR after partial hepatectomy and undergo apoptosis on nerve growth factor stimulation［J］. Liver Int，2006，26(5):595-603.

［9］ Passino MA，Adams RA，Sikorski SL，et al. Regulation of hepatic stellate cell differentiation by the neurotrophin receptor p75NTR［J］.Science，2007，315(5820):1853-1856.

［10］ Chen X，Jiang HQ，Yang LT，et al. The expression of P75 in hepatic stellate cells of fibrotic human and rat liver［J］. Acta Anatomica Sinica，2006，37(1):66-68.陳新，姜慧卿，楊路亭，等. 神經(jīng)生長(zhǎng)因子低親和力受體在肝纖維化患者和大鼠肝星狀細(xì)胞的表達(dá)［J］. 解剖學(xué)報(bào)，2006，37(1):66-68.

［11］ Chen X，Jiang HQ，He ZG，et al. Increased expressions of NGF and its receptor P75 in liver of CCl4-induced toxic rats［J］. Basic＆Clinical Medicine，2007，27(7):802-805.陳新，姜慧卿，賀戰(zhàn)國(guó)，等. NGF 及其受體P75 在四氯化碳中毒性大鼠肝組織中表達(dá)增強(qiáng)［J］. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2007，27(7):802-805.