裘鎧杰，李大川，胡彥建，李紅影，吳德全，張鳳民，胡彥華

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院1.普通外科;2.消化內(nèi)科，黑龍江哈爾濱150086;3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室;4.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物教研室

肝癌是臨床上常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，在全球發(fā)病率男性位居第五位，女性位居第七位，而其病死率男性排第二位，女性排第六位，嚴(yán)重威脅著人們的健康和生命［1］，雖然其治療取得了可喜的進(jìn)展，但是總體治療效果仍不明顯［2-3］。肝癌動(dòng)物模型是研究肝癌發(fā)生、生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移機(jī)制的重要手段之一，也是尋求抗肝癌治療新途徑的有效方法之一［4］。目前，肝癌裸鼠移植模型是人體外最接近人類肝癌的整體實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停虼顺蔀楦伟?shí)驗(yàn)研究理想的動(dòng)物模型，尤其利用肝癌細(xì)胞直接注射接種建立肝癌裸鼠皮下移植瘤模型［5-6］及肝癌原位移植瘤模型［7］的方法已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用。但是，有關(guān)肝癌細(xì)胞接種前采用何種液體制懸未見明確報(bào)道。為此，本文選用具有代表性的高侵襲性人肝癌細(xì)胞株MHCC-97H，以不同的液體對(duì)肝癌細(xì)胞稀釋制懸后接種于裸鼠，制備肝癌裸鼠荷瘤模型(皮下和原位模型)，探討模型制備的最佳肝癌細(xì)胞制懸方法，為肝癌研究提供有效的動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1 人肝癌細(xì)胞株 高侵襲性人肝癌細(xì)胞株MHCC-97H 由上海復(fù)旦大學(xué)肝癌研究所饋贈(zèng)。

1.2 裸鼠 雄性BALB/c-nu 裸小鼠60 只，4 ～5 周齡，體質(zhì)量12 ～14 g(購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)。飼養(yǎng)于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室中，飼料、飲水、墊料、籠具均經(jīng)高壓蒸汽滅菌后使用，操作人員嚴(yán)格執(zhí)行SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作規(guī)程。許可證編號(hào):SCXK(京)2012-0001。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2孵箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含10%特級(jí)胎牛血清(上海博升生物技術(shù)有限公司代購(gòu))的DMEM 高糖培養(yǎng)液，每2 d全量換液，顯微鏡下觀察細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后用0.25%胰蛋白酶消化，以1∶3 傳代。

1.4 皮下移植瘤模型的建立方法 將30 只裸鼠隨機(jī)分為3 組，分別采用PBS 緩沖液(PBS 組)、無(wú)血清DMEM 溶液(DMEM 組)和含10%血清的DMEM 溶液(血清DMEM 組)制懸肝癌細(xì)胞，每組10 只。在細(xì)胞呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，收集培養(yǎng)的MHCC-97H 細(xì)胞，PBS組用PBS 緩沖液稀釋制備腫瘤細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度均為1 ×107個(gè)活細(xì)胞/ml，75%酒精消毒裸鼠背部，取0.2 ml注入裸鼠皮下;DMEM 組用無(wú)血清的DMEM 溶液稀釋肝癌細(xì)胞制懸;血清DMEM 組用含10%血清的DMEM 溶液稀釋肝癌細(xì)胞制懸，其余操作與PBS 組相同。接種完成后每日觀察裸鼠生存狀況和精神狀態(tài)，第2、3、4 周各用游標(biāo)卡尺測(cè)量一次皮下瘤長(zhǎng)短徑，按標(biāo)準(zhǔn)公式計(jì)算瘤體積:V=L ×W2×0.52(其中L 為最長(zhǎng)徑，W 為最短徑)，第4 周測(cè)量后當(dāng)日，逐只剖取腫瘤，稱量，記錄瘤重并計(jì)算成瘤率。腫瘤組織經(jīng)10%中性甲醛固定，石蠟切片，HE 染色，光鏡下觀察細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)的變化。

1.5 原位移植瘤模型的建立方法 將30 只裸鼠平均隨機(jī)分為3 組，分別采用PBS 緩沖液(PBS 組)、無(wú)血清DMEM 溶液(DMEM 組)和含10%血清的DMEM 溶液(血清DMEM 組)制懸肝癌細(xì)胞，每組10 只。在細(xì)胞呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，收集培養(yǎng)的MHCC-97H 細(xì)胞。PBS 組用PBS 緩沖液稀釋制備腫瘤細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度均為1 ×107個(gè)活細(xì)胞/ml，1%戊巴比妥鈉(60 mg/kg)腹腔注射麻醉。沿鼠左肋緣下方開腹，充分暴露肝左葉，1 ml 無(wú)菌注射器抽取細(xì)胞懸液緩慢推進(jìn)肝臟約150 μl，逐層用4-0 無(wú)損傷線縫合關(guān)腹。術(shù)后正常飲食，未應(yīng)用抗生素;DMEM 組用無(wú)血清的DMEM 溶液稀釋腫瘤細(xì)胞制懸;血清DMEM 組用含10%血清的DMEM 溶液稀釋腫瘤細(xì)胞制懸，其余操作與PBS 組相同。接種完成后，每日觀察裸鼠生存狀況和精神狀態(tài)，4 周后逐只剖腹探查，肉眼下觀察有無(wú)肝臟原位腫瘤形成并計(jì)算成瘤率，腫瘤組織經(jīng)10%中性甲醛固定，石蠟切片，HE 染色，光鏡下觀察細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)的變化。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料應(yīng)用x ±s 表示，計(jì)數(shù)資料應(yīng)用率表示。計(jì)量資料的比較采用單因素方差分析，計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 裸鼠皮下瘤的體積與瘤重的比較 3 組裸鼠均在1 周后開始出現(xiàn)肉眼可見的約1 mm 左右的腫瘤，質(zhì)地偏硬，可活動(dòng)，2 ～3 周后，腫瘤的生長(zhǎng)速度有所加快，約4 周后，腫瘤的體積可增至1 cm3以上(見圖1)。處死裸鼠后取出瘤體，肉眼觀察:移植瘤為單個(gè)瘤塊，瘤體質(zhì)地偏硬，顏色呈淡粉紅色，表面有血管分布(見圖2)。剖視為魚肉樣外觀，中心可見壞死灶;鏡下觀察:瘤體組織內(nèi)有大量深染巨核細(xì)胞，異形性明顯，多數(shù)見核分裂相(見圖3)。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，PBS 組、DMEM 組及血清DMEM 組的腫瘤體積及瘤重相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05，見表1)。

2.2 裸鼠皮下瘤模型成瘤率的比較 3 組裸鼠分別觀察4 周，全部存活。結(jié)果顯示，PBS 組的成瘤率為90%(9/10)，DMEM 組的成瘤率為100%(10/10)，血清DMEM 組的成瘤率為40%(4/10)，DMEM 組的成瘤率與PBS 組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，血清DMEM 組的成瘤率與PBS 組及DMEM 組相比，有明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

2.3 裸鼠原位瘤模型成瘤率的比較 3 組裸鼠術(shù)后生存狀況良好。4 周后，將裸鼠處死，開腹觀察肝臟大體情況，可見裸鼠肝臟表面密布大小不等白色腫瘤灶(見圖4)。有些腫瘤灶突出于肝臟表面形成較大質(zhì)硬腫塊(見圖5)。組織切片HE 染色可見腫瘤灶散布于肝臟內(nèi)，大小不一，位于肝臟邊緣者較大，腫瘤細(xì)胞較正常肝臟細(xì)胞深染，核大，可見分裂相及多核，可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(見圖6)。結(jié)果顯示，PBS 組的成瘤率(90%)明顯高于DMEM 組(40%)及血清DMEM 組(20%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，DMEM 組的成瘤率高于血清DMEM 組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。

圖1 皮下移植瘤模型外觀;圖2 皮下移植瘤肉眼觀圖;圖3 皮下移植瘤病理切片(100 ×)Fig 1 Human hepatoma carcinoma cell line subcutaneous xenograft;Fig 2 Gross observation of the subcutaneous xenograft tumor;Fig 3 Pathological observation of the subcutaneous xenograft tumor (100 ×)

表1 裸鼠皮下瘤體積與瘤重的比較(x±s)Tab 1 Comparison of volum and weight of the subcutaneous xenograft tumor (x±s)

圖4 裸鼠原位瘤多發(fā)灶大體觀;圖5 裸鼠原位瘤單發(fā)灶大體觀;圖6 原位移植瘤病理切片(100 ×)Fig 4 Multiple liver xenograft tumors in nude mice;Fig 5 Single liver xenograft tumor in nude mice;Fig 6 Pathological observation of the liver xenograft tumor (100 ×)

3 討論

肝癌是嚴(yán)重危害人類生命健康的臨床常見的惡性腫瘤之一，雖然目前通過(guò)綜合治療模式，使肝癌的5 年生存率有了顯著的提高，但是我國(guó)每年仍有約11 萬(wàn)人死于肝癌，占全世界肝癌死亡人數(shù)的45%，所以肝癌相關(guān)方面的研究對(duì)于我國(guó)乃至世界具有重大意義。肝癌的基礎(chǔ)與臨床研究迫切需要能真正模擬肝癌在人體內(nèi)自然生長(zhǎng)、侵襲及轉(zhuǎn)移全部過(guò)程的動(dòng)物模型。目前，肝癌裸鼠移植瘤模型是人體外最接近人類肝癌的整體實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。雖然經(jīng)過(guò)學(xué)者們多年來(lái)的實(shí)驗(yàn)摸索，肝癌裸鼠移植瘤模型已經(jīng)比較成熟，但仍會(huì)有移植成功率不高、潛伏期長(zhǎng)以及存活率低等情況出現(xiàn)，目前學(xué)者們認(rèn)為影響移植成功的因素主要有:鼠的品系、周齡、移植部位、移植細(xì)胞數(shù)、生長(zhǎng)環(huán)境等［8-9］，但是尚未有研究成果表明腫瘤細(xì)胞懸液的制備方法也會(huì)影響裸鼠移植瘤模型的建立，本實(shí)驗(yàn)組圍繞這一設(shè)想展開了一系列深入的研究。

PBS 緩沖液和無(wú)血清的DMEM 溶液是目前國(guó)內(nèi)外制造肝癌移植瘤模型時(shí)常用來(lái)稀釋肝癌細(xì)胞制懸的液體［5，7］，含10%血清的DMEM 溶液是肝癌細(xì)胞體外培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基。因而本研究選用以上3 種液體稀釋肝癌細(xì)胞制懸后建立肝癌裸鼠移植瘤模型(皮下瘤及原位瘤)并進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn):制造肝癌裸鼠皮下瘤模型時(shí)雖然腫瘤的生長(zhǎng)過(guò)程(體積、瘤重)和選用的肝癌細(xì)胞制懸液體無(wú)關(guān);但是，相比含10%血清的DMEM 溶液，選用PBS 緩沖液或者無(wú)血清的DMEM 對(duì)肝癌細(xì)胞進(jìn)行稀釋制懸能明顯提高造模的成功率。制造肝癌裸鼠原位瘤模型時(shí)，相比無(wú)血清的DMEM 溶液或含血清的DMEM 溶液，選用PBS 緩沖液對(duì)肝癌細(xì)胞進(jìn)行稀釋制懸具有更高的造模成功率。

裸鼠皮下移植瘤模型是研究人類腫瘤生物特性及腫瘤治療常用的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。這種模型可以保持原發(fā)腫瘤本身所具有的形態(tài)特征和遺傳性，已成為體內(nèi)研究惡性腫瘤生物學(xué)特性和篩選抗癌藥物的理想工具［10］。本實(shí)驗(yàn)組通過(guò)建立肝癌裸鼠皮下瘤模型發(fā)現(xiàn):制造肝癌裸鼠皮下瘤模型時(shí)雖然腫瘤的生長(zhǎng)過(guò)程(體積、瘤重)和選用的肝癌細(xì)胞制懸液體無(wú)關(guān);但是，相比含10%血清的DMEM 溶液，選用PBS 緩沖液或者無(wú)血清的DMEM 對(duì)肝癌細(xì)胞進(jìn)行稀釋制懸能明顯提高造模的成功率。含血清的DMEM 溶液相比其余兩種液體最大的區(qū)別在于血清，血清在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中起著多方面的作用，但是也存在一些弊端，比如血清成分不明確，存在不少有害成分，比如補(bǔ)體、免疫球蛋白和一些生長(zhǎng)抑制因子等;并且不同動(dòng)物、不同批次的血清成分和活性也有很大不同［11-12］;另一方面，不同的血清對(duì)細(xì)胞的損傷效應(yīng)與血清供體和靶細(xì)胞的親緣關(guān)系有關(guān)，它們之間的親緣關(guān)系越遠(yuǎn)，損傷效應(yīng)的活性越高，同種血清則沒(méi)有明顯的作用［13］，以上原因可能導(dǎo)致含血清的DMEM 溶液不適宜用來(lái)稀釋肝癌細(xì)胞制懸而建立裸鼠移植瘤模型，但是關(guān)于為什么不影響皮下瘤生長(zhǎng)過(guò)程的原因有待于進(jìn)一步的探究。

原位移植瘤模型能較好的模擬腫瘤細(xì)胞在人體內(nèi)生長(zhǎng)的微環(huán)境，具有較快的生長(zhǎng)速度、較強(qiáng)的侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移能力，是目前研究腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的最佳模型。本實(shí)驗(yàn)組通過(guò)建立肝癌裸鼠原位瘤模型發(fā)現(xiàn):制造此模型時(shí)，相比無(wú)血清的DMEM 溶液或含血清的DMEM溶液，選用PBS 緩沖液對(duì)肝癌細(xì)胞進(jìn)行稀釋制懸具有更高的造模成功率。比較3 種用來(lái)制懸的液體，除了上述血清方面的原因值得我們關(guān)注外，另一方面，DMEM 溶液相比PBS 緩沖液雖然在無(wú)機(jī)鹽成分、pH等方面無(wú)明顯區(qū)別，但是前者含有大量的高糖及氨基酸成分，肝臟是體內(nèi)最主要的葡萄糖及氨基酸代謝場(chǎng)所，大量的高糖與氨基酸直接進(jìn)入肝臟將影響許多與代謝相關(guān)的基因［14］，并且，糖與氨基酸超過(guò)肝臟的耐受能力也會(huì)在一定程度上損傷肝臟細(xì)胞，所以，這可能是DMEM 溶液不適宜用來(lái)稀釋肝癌細(xì)胞制懸而建立肝癌裸鼠原位瘤模型的原因之一，但是更多的可能原因與具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究與探討。

總之，本實(shí)驗(yàn)組通過(guò)選用不同液體對(duì)肝癌細(xì)胞制懸后建立肝癌裸鼠移植瘤模型，優(yōu)選造模方法，為肝癌的研究和治療奠定了一定的基礎(chǔ)。

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