齊曉光，祁春艷，汪進(jìn)良，尹 航，胡 毅

中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院1.腫瘤內(nèi)一科;2.國(guó)賓一科，北京100853

結(jié)腸癌在我國(guó)的發(fā)病率有增高的趨勢(shì)，其死亡率僅次于肺癌和肝癌，占我國(guó)惡性腫瘤第三位。近年來(lái)隨著對(duì)結(jié)腸癌發(fā)病機(jī)制、新一代化療藥物等研究的深入，盡管臨床預(yù)后有了一定改觀，但總體5 年生存率仍不足50%，大約40%的患者在5 年內(nèi)出現(xiàn)腹腔復(fù)發(fā)和肝轉(zhuǎn)移。最近在分子靶向治療方面比如西妥昔單抗等已經(jīng)取得了實(shí)質(zhì)性的進(jìn)展，其高效低毒的特性越來(lái)越引起人們的重視，但諸如此類(lèi)靶向藥物主要基于表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)基因的過(guò)表達(dá)等致癌機(jī)制的研究，那么影響結(jié)腸癌EGFR 過(guò)表達(dá)的機(jī)制如何，成為諸多學(xué)者感興趣的問(wèn)題之一，新近有研究泛素連接酶E3 WWP1(WW domain containing E3 ubiquitin protein ligase 1)在EGFR的表達(dá)中起關(guān)鍵作用，且進(jìn)一步研究表明，WWP1 在多種結(jié)腸癌細(xì)胞株、結(jié)腸癌組織中過(guò)表達(dá)，提示W(wǎng)WP1不僅與EGFR 的表達(dá)調(diào)節(jié)有關(guān)，也可能參與結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程;但其高表達(dá)與臨床特征、肝轉(zhuǎn)移等關(guān)系如何尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用結(jié)腸癌及其癌旁組織標(biāo)本，研究WWP1 在結(jié)腸癌及其癌旁組織中的表達(dá)情況及其與結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的關(guān)系，探討反映結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的敏感指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院2008 年1 月-2012 年7 月經(jīng)活檢或手術(shù)病理證實(shí)的結(jié)腸癌標(biāo)本118 例，男62 例，女56 例，年齡25 ～85 歲，平均年齡(58.0 ±7.5)歲。根據(jù)WHO 標(biāo)準(zhǔn)，病理組織學(xué)分級(jí):高分化30 例，中分化59 例，低分化29 例。53 例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，65 例無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，其中結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移48 例。

1.2 主要試劑 WWP1 抗體(H00011059-M01，Novus Biologicals，1∶1 000);免疫組化試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。

1.3 檢測(cè)方法 免疫組化采用SP 法，檢測(cè)結(jié)腸癌及其癌旁組織中WWP1 表達(dá)，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4 判定標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)染色程度和染色細(xì)胞百分比進(jìn)行評(píng)分。染色程度:基本不著色為0 級(jí)，著色呈淡黃色為1 級(jí)，著色呈黃色為2 級(jí)，著色呈棕褐色為3 級(jí)。染色陽(yáng)性細(xì)胞百分比:著色陽(yáng)性細(xì)胞占計(jì)數(shù)細(xì)胞百分比≤5%為0 級(jí)，6% ～25%為1 級(jí)，26% ～50%為2 級(jí)，≥51%為3 級(jí)。將胞質(zhì)染色程度分級(jí)與染色細(xì)胞百分比分級(jí)相乘，≥4 者為表達(dá)陽(yáng)性，0 ～3 者為表達(dá)陰性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 11.0 軟件進(jìn)行分析，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson 相關(guān)檢驗(yàn)，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 WWP1 在結(jié)腸癌及癌旁組織中的表達(dá) WWP1在結(jié)腸癌組織中明顯高表達(dá)，而在其對(duì)應(yīng)的癌旁組織中表達(dá)較低(見(jiàn)圖1)，進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析顯示，WWP1 在結(jié)腸癌及其癌旁組織中表達(dá)陽(yáng)性率分別為75. 4%(89/118)、21.2%(25/118)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=69.504，P ＜0.05)。

2.2 WWP1 在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及其與臨床特征分析 WWP1 在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)與性別、年齡、腫瘤分化程度、腫瘤大小均無(wú)明顯相關(guān)性，而隨著結(jié)腸癌進(jìn)展，如浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，其陽(yáng)性表達(dá)率逐漸提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05，見(jiàn)表1)。

圖1 WWP1 在結(jié)腸癌及其癌旁組織中的表達(dá)(200 ×) A:結(jié)腸癌旁組織;B:結(jié)腸癌Fig 1 Expression of WWP1 in colon cancer and paracancerous tissues A:paracancerous tissues;B:colon cancer

表1 結(jié)腸癌組織中WWP1 表達(dá)的臨床意義Tab 1 Clinical significance of the expression of WWP1 in colon cancer tissues

續(xù)表1

2.3 結(jié)腸癌組織中WWP1 表達(dá)與肝轉(zhuǎn)移的相關(guān)性分析 為進(jìn)一步分析WWP1 表達(dá)與有無(wú)結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移相關(guān)性，對(duì)兩者進(jìn)行Pearson 相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，WWP1 高表達(dá)與結(jié)腸癌伴肝轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)(r=0.232，P=0.011，見(jiàn)表2)。

表2 結(jié)腸癌組織中WWP1 表達(dá)與肝轉(zhuǎn)移關(guān)系Tab 2 The relationship between expression of WWP1 in colon cancer tissues and liver metastasis

3 討論

泛素化作為體內(nèi)蛋白質(zhì)翻譯后重要修飾之一，是蛋白質(zhì)降解的信號(hào)，大量研究表明泛素連接酶和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［1］，泛素化過(guò)程由3 種關(guān)鍵酶共同介導(dǎo)，在此過(guò)程中，泛素連接酶E3 的作用至關(guān)重要，它們介導(dǎo)活化的泛素從結(jié)合酶EZ 轉(zhuǎn)移到底物，不同的泛素連接酶作用于不同的底物蛋白，決定了泛素化修飾的特異性［2］，成為諸多學(xué)者探討的熱點(diǎn)問(wèn)題之一。

WWP1 是一種含有HECT 結(jié)構(gòu)域的E3 蛋白泛素連接酶，它位于8 號(hào)染色體q21［3］;近年來(lái)，有研究表明WWP1 與結(jié)腸癌EGFR 表達(dá)的負(fù)向調(diào)節(jié)密切相關(guān)［4］，另外，本研究結(jié)果提示，與WWP1 結(jié)腸癌癌旁組織相比，其在結(jié)腸癌組織中明顯高表達(dá)，但WWP1 高表達(dá)是否與結(jié)腸癌伴(或不伴)肝轉(zhuǎn)移有無(wú)相關(guān)性，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究正是基于此出發(fā)點(diǎn)，探討WWP1 在結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展及其肝轉(zhuǎn)移的關(guān)系，為結(jié)腸癌的早期診斷及治療、病程監(jiān)控提供一定的客觀依據(jù)。

本研究中，WWP1 在結(jié)腸癌組織中表達(dá)明顯高于其癌旁組織，WWP1 的高表達(dá)與結(jié)腸癌腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均呈顯著正相關(guān);進(jìn)一步分析表明，WWP1 高表達(dá)與結(jié)腸癌伴肝轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，提示W(wǎng)WP1 可能作為癌基因參與結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。Subik 等［2］研究顯示，WWP1 可介導(dǎo)MDA231 乳腺癌細(xì)胞侵襲及骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生，提示W(wǎng)WP1 不僅參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，同時(shí)與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，其機(jī)制可能為WWPI 通過(guò)銜接蛋白smad2 和smad7 分別間接的泛素化smad4 以及TGF-β 受體，從而負(fù)向調(diào)節(jié)TGF-β 腫瘤抑制通路［5］，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。

總之，本研究結(jié)果初步顯示，WWP1 作為結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的敏感指標(biāo)，不僅進(jìn)一步揭示了泛素連接酶和腫瘤的新關(guān)聯(lián)，有可能為結(jié)腸癌的早期診斷及治療、病程監(jiān)控提供一定的客觀依據(jù)。

［1］ Zhi X，Chen C. WWP1:a versatile ubiquitin E3 ligase in signaling and diseases［J］. Cell Mol Life Sci，2012，69(9):1425-1434.

［2］ Subik K，Shu L，Wu C，et al. The ubiquitin E3 ligase WWP1 decreases CXCL12-mediated MDA231 breast cancer cell migration and bone metastasis［J］. Bone，2012，50(4):813-823.

［3］ Lin JH，Hsieh SC，Chen JN，et al. WWP1 gene is a potential molecular target of human oral cancer［J］. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol，2013，116(2):221-231.

［4］ Chen C，Zhou Z，Liu R，et al. The WW domain containing E3 ubiquitin protein ligase 1 upregulates ErbB2 and EGFR through RING finger protein 11［J］. Oncogene，2008，27(54):6845-6855.

［5］ Chen C，Zhou Z，Ross JS，et al. The amplified WWP1 gene is a potential molecular target in breast cancer［J］. Int J Cancer，2007，121(1):80-87.