單海霞，黃廣清

徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤科，江蘇 徐州221006

隨著社會(huì)、環(huán)境和人們生活方式的變化，胃癌發(fā)病率日趨上升。作為第二大癌癥死因［1］，盡管治療方法已取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，如手術(shù)、化療、放療等，患者的預(yù)后和生存率仍然不佳。因此，探尋綜合治療胃癌的新途徑具有重要的意義。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)治療進(jìn)展期胃癌的報(bào)道較少，尤其是對(duì)使用DC-CIK 細(xì)胞免疫治療聯(lián)合化療治療的臨床療效評(píng)價(jià)。本研究以進(jìn)展期胃癌患者術(shù)后采用常規(guī)化療為對(duì)照組，觀察比較術(shù)后使用DC-CIK 聯(lián)合化療進(jìn)行治療的療效，從而為臨床推廣應(yīng)用提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2009 年11 月-2011 年4 月在徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院行胃癌根治術(shù)的患者90 例，男53 例，女37 例，年齡31 ～62 歲，平均年齡(37.84 ±9.25)歲。隨機(jī)分為對(duì)照組和觀察組，每組各45 例。對(duì)照組患者年齡31 ～59 歲，平均年齡(36.53 ±8.74)歲;治療組患者年齡33 ～62 歲，平均年齡(35. 26 ±10.36)歲。入選標(biāo)準(zhǔn):(1)術(shù)后病理診斷根據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)分期標(biāo)準(zhǔn)證實(shí)為進(jìn)展期［2］;(2)年齡30～78 歲;(3)造血功能正常，心、肝、腎等重要臟器功能正常，無自身免疫疾病;(4)卡氏評(píng)分(Karnofsky performance status，KPS)≥60 分;(5)所有患者術(shù)前未經(jīng)放療與任何方案化療。凡不符合上述標(biāo)準(zhǔn)中任何一條者均不納入研究范圍。

1.2 治療 對(duì)照組患者術(shù)后采用TP 方案(紫杉醇175 mg/m2溶于500 ml 生理鹽水中靜脈滴注，間隔1 h給予順鉑30 mg/m2，治療周期為21 d)化療，共3 個(gè)周期;觀察組患者術(shù)后采用TP 化療聯(lián)合DC-CIK 細(xì)胞免疫治療方案，即在完成3 個(gè)周期的TP 治療后的第14天，將制備好的DC-CIK 細(xì)胞回輸入患者體內(nèi)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均自愿入組，患者或家屬簽署知情同意書。

1.3 DC-CIK 細(xì)胞的制備和質(zhì)檢 觀察組45 例患者于化療前使用COBE 血細(xì)胞分離機(jī)采集患者自身的外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，細(xì)胞數(shù)量需達(dá)到1 ～3 ×108個(gè)。調(diào)整PBMC 細(xì)胞濃度，置于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。依次加入重組人IFN-g、CD3 單克隆抗體、重組人IL-2 刺激CIK 細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，在培養(yǎng)的第7 天，收獲CIK 細(xì)胞。加入含重組人GMCSF 和重組人IL-4 的無血清培養(yǎng)液，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，誘導(dǎo)單核細(xì)胞向DC 細(xì)胞分化;每3 d 半量換液1 次，并補(bǔ)足細(xì)胞因子。將收獲的DC 細(xì)胞和CIK 細(xì)胞按1∶10 的個(gè)數(shù)比共培養(yǎng)，無血清培養(yǎng)液中添加重組人IL-2(300 U/ml);每3 d 半量換液1 次，并補(bǔ)加重組人IL-2(300 U/ml)。在第7 天收集細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)量應(yīng)達(dá)到1 ×1010個(gè)以上。

DC-CIK 細(xì)胞的質(zhì)檢:臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)結(jié)果活細(xì)胞數(shù)目;流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面CD3、CD8、CD56 等分子的表達(dá);細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn):以DC-CIK 細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞使用乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒檢測(cè)效應(yīng)細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷率;取少量培養(yǎng)物進(jìn)行細(xì)菌、真菌培養(yǎng)，并檢測(cè)支原體、衣原體及內(nèi)毒素。

1.4 免疫功能評(píng)價(jià) 收集對(duì)照組和觀察組患者治療前及治療后1 個(gè)月外周血各5 ml，使用流式細(xì)胞儀分析血液中CD3+、CD4+、CD8+以及CD56+細(xì)胞的百分比。ELISA 法檢測(cè)細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-10 的表達(dá)水平，操作方法參照試劑盒說明書。

1.5 近期療效評(píng)價(jià) 近期療效按RECIST 標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一評(píng)價(jià)［3］，每2 個(gè)周期進(jìn)行評(píng)價(jià)，分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、穩(wěn)定(SD)和進(jìn)展(PD)，以CR +PR 計(jì)算有效率;以CR+PR+SD 計(jì)算疾病控制率(DCR)。1.6 其他療效評(píng)定指標(biāo) 對(duì)兩組患者術(shù)后36 個(gè)月內(nèi)進(jìn)行跟蹤調(diào)查，定期復(fù)查了解腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等情況。計(jì)算兩組患者的局部復(fù)發(fā)率、生存率。同時(shí)患者在觀察治療過程中每次輸注DC-CIK 細(xì)胞過程中有無發(fā)熱、過敏等不良反應(yīng)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。各組之間的差異進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，兩兩比較采用t 檢驗(yàn)。P ＜0. 05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 治療前后患者外周血T 細(xì)胞亞群變化 兩組患者經(jīng)治療后T 細(xì)胞免疫功能檢測(cè)結(jié)果顯示，觀察組CD3+CD4+T 淋巴細(xì)胞百分比、CD4+/CD8+比率和NK 細(xì)胞百分比較治療前及對(duì)照組治療后均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);而CD3+CD8+T 淋巴細(xì)胞百分比相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05，見圖1)。

2.2 治療前后對(duì)患者細(xì)胞因子的影響 觀察組IFNγ 明顯升高，與治療前及對(duì)照組治療后相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);IL-4、IL-6、IL-10 變化無明顯差異(P ＞0.05)。對(duì)照組治療后IL-6 升高，與治療前及觀察組治療后相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);IFN-γ、IL-4、IL-10 降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05，見表1)。

2.3 近期療效評(píng)價(jià) 對(duì)照組中CR 0 例、PR 8 例、SD 17 例、PD 20 例;觀察組中CR 0 例、PR 19 例、SD 12例、PD 14 例。對(duì)照組和觀察組的有效率分別為17.78%和42. 22%，兩組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。觀察組較對(duì)照組控制率高(68.89% vs 55.56%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

2.4 兩組患者累積復(fù)發(fā)率、生存率比較 觀察組1、2、3 年累積復(fù)發(fā)率明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);觀察組1 年累積生存率(62.22%)高于對(duì)照組(46.67%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);而觀察組2、3 年累積生存率與對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05，見表2)。

2.5 DC-CIK 聯(lián)合化療的安全性評(píng)價(jià) 45 例患者在接受DC-CIK 聯(lián)合化療治療過程中，有4 例在治療2.5 h 內(nèi)出現(xiàn)輕度體溫升高，發(fā)熱癥狀出現(xiàn)后3 h 內(nèi)均自行緩解。無1 例患者出現(xiàn)過敏癥狀。

圖1 觀察組與對(duì)照組治療前后外周血T 細(xì)胞亞群的變化 A:CD3 +CD4 +T 淋巴細(xì)胞百分比;B:CD3 +CD8 +T 淋巴細(xì)胞百分比;C:CD4 + /CD8 +比率;D:NK 細(xì)胞百分比Fig 1 The changes of the peripheral blood T cell subsets between control group and observation group A:the percentage of CD3 +CD4 + T lymphocytes;B:the percentage of CD3 +CD8 + T lymphocytes;C:the ratio of CD4 + /CD8 +;D:the percentage of NK cells

表1 兩組患者治療前后細(xì)胞因子變化(ng/L)Tab 1 The changes of cytokines between two groups before and after treatment (ng/L)

表2 兩組患者累積復(fù)發(fā)率、生存率比較［例數(shù)(%)］Tab 2 Comparison of relapse rates and survival rates between two groups［n(%)］

3 討論

胃癌是我國(guó)常見的消化道惡性腫瘤之一，術(shù)后進(jìn)行化療對(duì)控制局部腫瘤復(fù)發(fā)具有顯著效果，但化療僅能扼殺一定數(shù)量的腫瘤細(xì)胞，難以清除微小病變。因此，尋找能夠降低腫瘤復(fù)發(fā)率，提高患者生存率的治療方法是非常有意義的。近20 年來，腫瘤免疫學(xué)和分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展為癌癥治療提供了更為有效的治療手段，尤其在改善患者預(yù)后方面表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。CIK 細(xì)胞是一種同時(shí)具有T 淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞雙重抗腫瘤活性的細(xì)胞群，具有體外高度擴(kuò)增、殺瘤活性高、殺瘤譜廣，對(duì)正常組織毒性低等特點(diǎn)。DC細(xì)胞是唯一能夠顯著刺激初始T 細(xì)胞增殖的抗原遞呈細(xì)胞，能夠觸發(fā)機(jī)體適應(yīng)性T 細(xì)胞免疫應(yīng)答［4］。將CIK 細(xì)胞與DC 細(xì)胞在體外共培養(yǎng)再回輸給患者，可對(duì)腫瘤進(jìn)行免疫治療，二者之間相互作用可誘發(fā)免疫應(yīng)答，從而確保高效和諧的免疫反應(yīng)［5］。在免疫治療學(xué)的迅速發(fā)展下，細(xì)胞免疫治療手段已逐步應(yīng)用到包括胃癌、膀胱癌、乳腺癌在內(nèi)的多種腫瘤的治療上［6］。DC 是機(jī)體內(nèi)重要的抗原遞呈細(xì)胞，并且能夠釋放大量的細(xì)胞因子如INF 和IL-12 通過多種途徑調(diào)節(jié)腫瘤免疫應(yīng)答［7］。大量研究表明癌癥患者的免疫系統(tǒng)較弱，包括CD3+CD4+T 細(xì)胞降低、CD3+CD8+增加、CD4+/CD8+比率降低以及NK 細(xì)胞數(shù)目下降［8］，激活患者腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答對(duì)于提高腫瘤的臨床治療效果具有極為重要的臨床意義。CIK 作為抗腫瘤活性的細(xì)胞群，其細(xì)胞內(nèi)CD16+CD56+雙陽(yáng)性細(xì)胞能夠釋放大量的抗腫瘤細(xì)胞因子并對(duì)腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出較強(qiáng)的毒性作用［9］，給予外源性的CIK 則可增強(qiáng)機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺滅能力，且與化療藥物起到較好的療效協(xié)同作用。因此，在本研究中，我們采用DC-CIK 聯(lián)合化療治療進(jìn)展期胃癌患者，研究其對(duì)進(jìn)展期胃癌患者免疫功能、腫瘤復(fù)發(fā)率和生存率的影響。

本研究中，觀察組和對(duì)照組兩組患者治療前外周血中細(xì)胞因子與正常人群明顯不同，然而在經(jīng)過DCCIK 生物治療聯(lián)合化療后，觀察組的CD3+CD4+T 淋巴細(xì)胞百分比、CD4+/CD8+比率、NK 細(xì)胞百分比、細(xì)胞因子IFN-γ 較治療前均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外，觀察組患者外周血中各細(xì)胞因子水平均比對(duì)照組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果提示，DC-CIK 細(xì)胞免疫治療聯(lián)合化療能夠顯著提高患者的免疫功能，提高患者體內(nèi)抗腫瘤免疫應(yīng)答。要跟東等［10］使用DC-CIK 細(xì)胞聯(lián)合化療對(duì)37 例進(jìn)展期胃癌患者治療的結(jié)果顯示，所有患者的CD4+/CD8+比率、NK 細(xì)胞百分比等較治療前均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且在改善患者的生存率和復(fù)發(fā)率方面也有積極的臨床意義。我們?yōu)槠?6 個(gè)月的隨訪結(jié)果顯示，觀察組患者的生存率高于對(duì)照組且復(fù)發(fā)率較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示DC-CIK 聯(lián)合化療能夠有效降低進(jìn)展期胃癌的復(fù)發(fā)率和提高患者的生存率，臨床意義較為明確，與蔡俊霞等［11］的臨床研究結(jié)果一致。在不良反應(yīng)方面，除4例于DC-CIK 細(xì)胞回輸期間出現(xiàn)輕微發(fā)燒以外，未見嚴(yán)重不良反應(yīng)，安全性良好。

總之，使用DC-CIK 聯(lián)合化療對(duì)進(jìn)展期胃癌進(jìn)行治療具有較為明確的臨床療效，為免疫學(xué)在胃腸腫瘤治療方面的應(yīng)用提供了較為可靠的臨床證據(jù)，值得臨床推廣和進(jìn)一步研究。

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