張緒良，黃丹青

黃石市中心醫(yī)院1.腫瘤外科;2.超聲科，湖北 黃石435000

胃癌的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移是多步驟、多階段、多種因素相互作用的結(jié)果，目前具體機(jī)制還不清楚。癌細(xì)胞黏附基底膜，降解細(xì)胞外基質(zhì)，穿過(guò)基底膜，在間質(zhì)中移動(dòng)，到達(dá)血管壁，進(jìn)入血管，從而形成腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展［1］。研究與細(xì)胞外基質(zhì)生成降解相關(guān)的酶即賴氨酰氧化酶(lysyl oxidase，LOX)和血管生成相關(guān)的細(xì)胞因子即血管內(nèi)皮因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)成為當(dāng)前腫瘤研究的熱點(diǎn)。LOX是細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的主要成分，能夠氧化膠原蛋白和彈性蛋白上的特殊氨基酸殘基，使膠原蛋白和彈性蛋白形成共價(jià)鍵，對(duì)ECM 的發(fā)育、成熟和維持其穩(wěn)定性起重要作用［2］。VEGF 是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性的肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子，可在體內(nèi)誘導(dǎo)血管新生［3］。有相關(guān)文獻(xiàn)證實(shí)，LOX 與VEGF 在胃癌中均有所表達(dá)，與胃癌的發(fā)生密切相關(guān)，但與胃癌的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移有何關(guān)系并不清楚，有待進(jìn)一步研究。本研究以胃癌為研究對(duì)象，血管及ECM 為切入點(diǎn)，研究與血管生成及ECM 成熟相關(guān)的VEGF 與LOX 在不同浸潤(rùn)深度的胃癌組織、伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中的表達(dá)情況，研究其在胃癌浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移進(jìn)展中的作用，現(xiàn)總結(jié)如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集黃石市中心醫(yī)院普外科及腫瘤科行手術(shù)切除的新鮮胃癌組織65 例，標(biāo)本均經(jīng)過(guò)病理科醫(yī)生共同證實(shí)。所有患者術(shù)前均未接受放化療，男45 例，女20 例，年齡23 ～88 歲，中位年齡63.5 歲，患者的分組是經(jīng)查閱病案資料結(jié)合手術(shù)所見及術(shù)后病理檢查及參照1997 年國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)頒布的胃癌PTNM 分期標(biāo)準(zhǔn)，其中T1T2有30 例，T3T4有35 例，伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的有53 例，完全無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的有12 例。將新鮮的胃癌組織標(biāo)本分2 份，一份用10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，用作HE 染色，另一份立即放入液氮桶中保存速凍并隨后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存，準(zhǔn)備做Western blotting 檢測(cè)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 在冰面上EP 管內(nèi)將胃癌組織剪碎至漿糊狀提取蛋白，用酶標(biāo)儀測(cè)定A562，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白濃度。通過(guò)灌膠、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后加抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供的兔抗人一抗LOX，兔抗人一抗VEGF)，最后通過(guò)發(fā)光，結(jié)果以目的條帶面積灰度值做半定量檢測(cè)，測(cè)出LOX、VEGF 的表達(dá)強(qiáng)度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)所得的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以x ±s 表示，兩組間差異性比較采用t 檢驗(yàn)，胃癌組織中LOX、VEGF 表達(dá)相關(guān)性研究用Pearson 相關(guān)分析，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LOX 在T1T2胃癌與T3T4胃癌中的表達(dá) 用Western blotting 方法檢測(cè)T1T2胃癌與T3T4胃癌中LOX 蛋白的表達(dá)，具體方法:實(shí)驗(yàn)中用HRP 標(biāo)記的βaction 為內(nèi)對(duì)照(分子量為42 kDa)，查閱相關(guān)文獻(xiàn)提示，LOX 蛋白的分子量為32 kDa，選用分子量為18 ～179 kDa 的Marker 作為實(shí)驗(yàn)中LOX 蛋白條帶及內(nèi)參條帶定性的標(biāo)準(zhǔn)。為了能更清楚的與內(nèi)參對(duì)比檢測(cè)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確度，實(shí)驗(yàn)中將LOX 蛋白及內(nèi)參蛋白轉(zhuǎn)移至同一張PVDF 膜上，照相完之后，測(cè)定LOX 蛋白在胃癌T1T2及胃癌T3T4中的光密度值，計(jì)算LOX 蛋白的表達(dá)水平。LOX 在T3T4胃癌中的相對(duì)表達(dá)量為0.6003±0.1279，在T1T2胃癌中的相對(duì)表達(dá)量為0.4278 ±0.1437，LOX 在T3T4胃癌中的表達(dá)水平明顯高于T1T2胃癌，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05，見圖1、表1)。

圖1 Western blotting 檢測(cè)LOX 蛋白在T1T2 胃癌及T3T4 胃癌中的表達(dá) a:T1T2 胃癌;b:T3T4 胃癌Fig 1 Expression of LOX protein in T1T2 and T3T4 gastric cancer by Western blotting a:T1T2 gastric cancer;b:T3T4 gastric cancer

2.2 VEGF 在T1T2胃癌與T3T4胃癌中的表達(dá) 用Western blotting 方法檢測(cè)T1T2胃癌及胃癌T3T4中VEGF 蛋白的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)中用HRP 標(biāo)記的β-action 為內(nèi)對(duì)照(分子量為42 kDa)，查閱相關(guān)文獻(xiàn)提示，VEGF蛋白的分子量為23 kDa，選用分子量為18 ～179 kDa的Marker 作為實(shí)驗(yàn)中VEGF 蛋白條帶及內(nèi)參條帶定性的標(biāo)準(zhǔn)。為了便于觀察VEGF 蛋白與內(nèi)參蛋白之間的差異性，實(shí)驗(yàn)中將其轉(zhuǎn)移至不同的PVDF 膜，照相完之后，測(cè)定VEGF 蛋白在T1T2胃癌及T3T4胃癌中的光密度值，計(jì)算VEGF 蛋白的表達(dá)水平。VEGF 在T3T4胃癌中的相對(duì)表達(dá)量為0.6975 ±0.1639，在T1T2胃癌中的相對(duì)表達(dá)量為0. 4263 ±0. 1128，VEGF 在T3T4胃癌中的表達(dá)水平明顯高于T1T2胃癌，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05，見圖2、表1)。

圖2 VEGF 蛋白在T1T2 胃癌及T3T4 胃癌中的表達(dá) a:T1T2胃癌;b:T3T4 胃癌Fig 2 Expression of VEGF protein in T1T2 and T3T4 gastric cancer a:T1T2 gastric cancer;b:T3T4 gastric cancer

2.3 LOX 在伴有與不伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中表達(dá) 用Western blotting 方法檢測(cè)胃癌伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中LOX 蛋白的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)中用HRP標(biāo)記的β-action 為內(nèi)對(duì)照(分子量為42 kDa)，查閱相關(guān)文獻(xiàn)提示，LOX 蛋白的分子量為32 kDa，選用分子量為18 ～179 kDa 的Marker 作為實(shí)驗(yàn)中LOX 蛋白條帶及內(nèi)參條帶定性的標(biāo)準(zhǔn)。為了能更清楚的與內(nèi)參對(duì)比檢測(cè)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確度，實(shí)驗(yàn)中將LOX 蛋白及內(nèi)參蛋白轉(zhuǎn)移至同一張PVDF 膜上，照相完之后，測(cè)定在胃癌伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及胃癌不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中光密度值，計(jì)算LOX 蛋白的表達(dá)水平。LOX 在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌中的相對(duì)表達(dá)量為0.6827 ±0.1987，在無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌中的相對(duì)表達(dá)量為0.4235 ±0.1763，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌LOX 的表達(dá)水平明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05，見圖3、表2)。

表1 LOX、VEGF 在T1T2 胃癌和T3T4 胃癌組織中的表達(dá)(x±s)Tab 1 Expression of LOX，VEGF in the T1T2 and T3T4 gastric carcinoma tissue (x±s)

圖3 LOX 蛋白在胃癌伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的表達(dá) a:胃癌不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移;b:胃癌伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移Fig 3 Expression of LOX protein in the gastric carcinoma with lymph node metastasis and without a:without lymph node metastasis;b:with lymph node metastasis

2.4 VEGF 在伴有與不伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中表達(dá) 用Western blotting 方法檢測(cè)胃癌伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與胃癌不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中VEGF 蛋白的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)中用HRP 標(biāo)記的β-action 為內(nèi)對(duì)照(分子量為42 kDa)，查閱相關(guān)文獻(xiàn)提示，VEGF 蛋白的分子量為23 kDa，選用分子量為18 ～179 kDa 的Marker 作為實(shí)驗(yàn)中VEGF 蛋白條帶及內(nèi)參條帶定性的標(biāo)準(zhǔn)。為了便于觀察VEGF 蛋白與內(nèi)參蛋白之間的差異性，實(shí)驗(yàn)中將其轉(zhuǎn)移至不同的PVDF 膜，照相完之后，測(cè)定VEGF 蛋白在胃癌伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與胃癌不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中蛋白的光密度值，計(jì)算VEGF 蛋白的表達(dá)水平。VEGF 在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌中的相對(duì)表達(dá)量為0.6769 ±0.1659，在無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌中的相對(duì)表達(dá)量為0.4128 ±0.1471，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌VEGF 的表達(dá)水平明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05，見圖4、表2)。

2.5 LOX 與VEGF 在胃癌進(jìn)展中的關(guān)系 在65 例T1T2與T3T4胃癌組織中，LOX 與VEGF 的表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.735，P ＜0.05)，在伴有與不伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌組織中，LOX 與VEGF 的表達(dá)水平也呈正相關(guān)(r=0.914，P ＜0.05)。

圖4 VEGF 蛋白在胃癌伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的表達(dá) a ～b:胃癌伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移;c ～d:胃癌不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移Fig 4 Expression of VEGF protein in the gastric carcinoma with lymph node metastasis and without a ～b:gastric carcinoma with lymph node metastasis;c ～d:gastric cancer not associated with lymph node metastasis

表2 LOX、VEGF 在伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌組織中的表達(dá)(x±s)Tab 2 Expression of LOX，VEGF in the gastric carcinoma tissue with lymph node metastasis and without (x±s)

3 討論

胃癌為人類最常見的惡性腫瘤，對(duì)人類的危害很大，治療效果差的主要原因有兩個(gè)方面，一個(gè)是發(fā)現(xiàn)晚，大部分患者就診時(shí)已經(jīng)是晚期了，另一個(gè)是腫瘤發(fā)生浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個(gè)多步驟、復(fù)雜的過(guò)程。腫瘤在侵襲及轉(zhuǎn)移的過(guò)程中，首先得突破ECM，突破了ECM 的腫瘤進(jìn)入淋巴系統(tǒng)或者毛細(xì)血管，然后在遠(yuǎn)處形成新的腫瘤病灶，ECM 由間質(zhì)膠原蛋白、層粘連蛋白、彈性蛋白、纖維粘連蛋白、硫肝素蛋白多糖等組成，始終處在不斷代謝更新、降解重塑的動(dòng)態(tài)平衡中，它為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)提供環(huán)境，它可調(diào)節(jié)與其接觸的腫瘤細(xì)胞的基因表達(dá)，從而影響腫瘤的代謝、生長(zhǎng)、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移，因此，ECM 的動(dòng)態(tài)變化與腫瘤浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［4］。ECM 的降解與重建對(duì)腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移發(fā)揮著重要的作用，LOX 就是參與ECM作用的酶［5］。腫瘤的生長(zhǎng)與其密集的血管密切相關(guān)，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)VEGF 與腫瘤的血管形成有關(guān)。

LOX 的作用是使ECM 中的膠原蛋白和彈性蛋白形成共價(jià)鍵，因此，LOX 的產(chǎn)生與調(diào)節(jié)對(duì)于ECM 的發(fā)育及成熟和維持其穩(wěn)定性起重要作用。本研究中采用Western blotting 方法檢測(cè)不同時(shí)期胃癌組織中LOX 的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)LOX 在伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌中的表達(dá)有顯著性差異，因此可以推測(cè)LOX 的表達(dá)參與了胃癌的進(jìn)展，推測(cè)可能的原因是LOX 的異常導(dǎo)致ECM 的異常，打破了腫瘤轉(zhuǎn)移的生理屏障，促進(jìn)了腫瘤的轉(zhuǎn)移，這與馬麗娟等［6］研究提示LOX 在伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中高表達(dá)也是密切相關(guān)的，因此臨床上可以通過(guò)檢測(cè)胃癌組織中LOX 的表達(dá)水平，來(lái)預(yù)測(cè)胃癌的生物學(xué)行為，從而可以預(yù)測(cè)胃癌患者的預(yù)后，為患者治療方法提供一定的幫助。同時(shí)我們也發(fā)現(xiàn)，T3T4胃癌中LOX 的表達(dá)水平明顯高于T1T2，因此，LOX 與胃癌的浸潤(rùn)也是密切相關(guān)的。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)LOX 在腫瘤中的研究還不足，其參與腫瘤發(fā)生及發(fā)展的具體機(jī)制還不清楚，因此，進(jìn)一步研究LOX 在各種相關(guān)腫瘤中的作用成為必要，這也為臨床上治療各種腫瘤提供分子靶向標(biāo)記。

VEGF 為目前發(fā)現(xiàn)促進(jìn)血管生成最重要的因子之一，其可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡和遷移，因此在血管的生成中十分重要;VEGF 還可以通過(guò)刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生一氧化氮，達(dá)到維持血管平衡的作用，由于血管在各種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中扮演著舉足輕重的角色，因此，VEGF 在各種腫瘤的研究成為當(dāng)前的熱點(diǎn)，局部血管的生成與降解的平衡被打破之后，給腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移提供了便利的條件［7-8］。本研究中采用Western blotting 方法檢測(cè)T3T4胃癌中VEGF 的表達(dá)水平明顯高于T1T2，因此VEGF 與胃癌的浸潤(rùn)也是密切相關(guān)的，推測(cè)可能的原因是VEGF 表達(dá)的增強(qiáng)，導(dǎo)致周圍血管豐富，在周圍環(huán)境及機(jī)體內(nèi)環(huán)境各種因素作用下，使腫瘤從淺層向深層浸潤(rùn)。本研究也提示VEGF 在胃癌伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的表達(dá)差異顯著，因此可以推測(cè)VEGF 的表達(dá)參與了胃癌的進(jìn)展，可能的原因是VEGF 的異常增加可以為腫瘤的血行轉(zhuǎn)移提供便利，促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移，這與連培龍等［9］的研究相一致，因此臨床上可以通過(guò)檢測(cè)胃癌組織中VEGF 的表達(dá)水平，預(yù)測(cè)胃癌的生物學(xué)行為，從而可以預(yù)測(cè)胃癌患者的預(yù)后，為患者的治療方案提供一定的參考。綜合本實(shí)驗(yàn)中VEGF 的表達(dá)，可以總結(jié)為VEGF 在胃癌的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移發(fā)展中有重要作用，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上，LOX 與VEGF 在胃癌不同進(jìn)展期中的表達(dá)呈正相關(guān)，因此可以推測(cè)它們?cè)谖赴┙?rùn)、轉(zhuǎn)移過(guò)程中具有協(xié)同作用，可能是由于VEGF 的異常表達(dá)，導(dǎo)致ECM 異常，從而引起LOX 的表達(dá)異常［10］。但是具體的機(jī)制目前還不清楚，兩者的相關(guān)性很有必要進(jìn)一步研究。在臨床上可以通過(guò)檢測(cè)LOX 與VEGF 的表達(dá)水平來(lái)預(yù)測(cè)胃癌患者的預(yù)后，為臨床上進(jìn)一步治療胃癌提供一定的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

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