，， ， ，(南華大學(xué)藥學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院生物技術(shù)系，湖南 衡陽(yáng) 421001)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

褪黑素通過(guò)抑制ROS改善胰島素抵抗HepG2細(xì)胞糖代謝

佘美華，蔣文艷，張瑤，楊娟，尹衛(wèi)東
(南華大學(xué)藥學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院生物技術(shù)系，湖南 衡陽(yáng) 421001)

目的探討褪黑素(MLT)對(duì)胰島素抵抗(IR)HepG2細(xì)胞葡萄糖代謝的影響及機(jī)制。方法培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，高糖高胰島素(25 mmol/L葡萄糖、1 μmol/L胰島素)誘導(dǎo)24h，建立IR細(xì)胞模型并給予MLT(1 nmol/L,10 nmol/L)處理。葡萄糖氧化酶法、蒽酮法和熒光探針?lè)z測(cè)HepG2細(xì)胞的糖攝取、糖原含量及活性氧(ROS)產(chǎn)率。結(jié)果HGI孵育HepG2細(xì)胞24 h后，細(xì)胞的葡萄糖攝取及糖原含量明顯減少(P<0.01)，ROS產(chǎn)率顯著增加(P<0.01)；而MLT處理增加了IR細(xì)胞葡糖糖的攝取(P<0.01)和糖原合成(P<0.05)，降低ROS的水平(P<0.01)。結(jié)論MLT可能通過(guò)抑制ROS的生成而改善氧化應(yīng)激，從而促進(jìn)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞葡萄糖的攝取和利用、增強(qiáng)其胰島素敏感性。

褪黑素； 胰島素抵抗； 葡萄糖攝取； 糖原； ROS

褪黑素(melatonin,MLT)是大腦松果體腺合成和分泌的一種吲哚類神經(jīng)內(nèi)分泌激素，具有調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律的作用。近年來(lái)研究表明褪黑素參與維持機(jī)體葡萄糖穩(wěn)態(tài)和改善胰島素敏感性[1]。如實(shí)施松果體切除術(shù)后的大鼠葡萄糖耐受不良、胰島素敏感性下降，而外源性補(bǔ)充MLT則能逆轉(zhuǎn)這一狀態(tài)[2]。Agil等[3]發(fā)現(xiàn)MLT能降低T2DM模型大鼠的高胰島素血癥和HOMA-IR。由于胰島素抵抗(IR)的發(fā)生與氧化應(yīng)激密切相關(guān)，氧化應(yīng)激狀態(tài)下ROS生成過(guò)多或清除不足，誘發(fā)細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化，并且它還能通過(guò)多條應(yīng)激敏感性信號(hào)通路影響基因表達(dá)和損傷細(xì)胞[4]，最終影響細(xì)胞的正常代謝。基于MLT、氧化應(yīng)激以及胰島素抵抗之間的聯(lián)系，本實(shí)驗(yàn)將探討MLT是否通過(guò)改善氧化應(yīng)激來(lái)改善胰島素抵抗。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

HepG2細(xì)胞購(gòu)于北京協(xié)和細(xì)胞資源中心；MLT由以色列Neurim Pharmaceuticals公司提供，DMSO溶解后用DMEM稀釋至工作濃度(DMSO終濃度低于0.01%)；胰島素(INS)、胎牛血清(FBS)均購(gòu)于Sigma公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組處理

HepG2細(xì)胞于37°C、5% CO2飽和濕度條件下，10% FBS的L-DMEM中培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，細(xì)胞融合后進(jìn)行傳代，轉(zhuǎn)入6孔板，待貼壁生長(zhǎng)后，分正常對(duì)照組，其余為胰島素抵抗模型組。正常對(duì)照組(IS組)以含5.5 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)；模型組則以含高糖高胰島素(25 mmol/L葡萄糖和1 μmol/L胰島素)的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，再用含或不含MLT(1 nmol/L、10 nmol/L)的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)6 h。

1.3 葡萄糖消耗實(shí)驗(yàn)

按照GOD-POD試劑盒(上海榮盛生物藥業(yè)有限公司)，將上述各組細(xì)胞分別給予有無(wú)100 nmol/L胰島素刺激6 h后，用葡萄糖氧化酶法檢測(cè)培養(yǎng)液中的葡萄糖含量，以未接種細(xì)胞空白復(fù)孔的糖含量均值相減，算出各孔細(xì)胞的葡萄糖攝入量。

1.4 細(xì)胞內(nèi)糖原含量檢測(cè)

按照糖原含量檢測(cè)試劑盒(南京建成)，采用葸酮法檢測(cè)上述細(xì)胞中的糖原含量。按說(shuō)明將細(xì)胞消化下來(lái)，離心沉淀并加入300 μL堿液，雙蒸水定容至500 μL，加顯色液，沸水浴5 min，冷卻后在620 nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定。

1.5 細(xì)胞內(nèi)ROS含量檢測(cè)

按照活性氧檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)，采用DCFH-DA熒光探針?lè)z測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)ROS的含量。先去除培養(yǎng)液，無(wú)血清DMEM洗滌，加入DCFH-DA工作液并孵育20 min；去除工作液，用預(yù)熱PBS洗3次；常規(guī)消化收集細(xì)胞，PBS洗滌3次，反復(fù)吹打成單細(xì)胞懸液，用熒光分光光度計(jì)(488 nm激發(fā)波長(zhǎng)，525 nm發(fā)射波長(zhǎng))檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 MLT改善高糖高胰島素誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞胰島素抵抗

基礎(chǔ)狀態(tài)下，各組細(xì)胞的葡萄糖攝入無(wú)明顯差異。在胰島素存在條件下，IS組細(xì)胞對(duì)葡萄糖攝入量明顯增加，為基礎(chǔ)狀態(tài)下的1.78倍(P<0.01)；高糖高胰島素處理后HepG2細(xì)胞(單純IR細(xì)胞組)，其胰島素介導(dǎo)的葡萄糖攝入量顯著低于IS組，下降29%(P<0.01)，說(shuō)明高糖高胰島素誘導(dǎo)發(fā)生胰島素抵抗；而對(duì)胰島素抵抗細(xì)胞進(jìn)行MLT處理后，其胰島素介導(dǎo)的葡萄糖攝入明顯增加(P<0.01)。

圖1 MLT對(duì)HepG2細(xì)胞胰島素抵抗模型糖消耗的影響1：IS；2：IR；3：1 nmol/L MLT；4：10 nmol/L MLT. 與基礎(chǔ)狀態(tài)葡萄糖攝入相比，*：P<0.01；胰島素介導(dǎo)的葡萄糖攝入，與IS組相比，#：P<0.01；與IR組相比，&：P<0.01，n=3

2.2 MLT對(duì)HepG2細(xì)胞胰島素抵抗模型糖原含量的影響

與正常對(duì)照HepG2細(xì)胞相比，高糖高胰島素誘導(dǎo)IR組細(xì)胞糖原含量減少約85%(P<0.01)；而對(duì)該IR模型細(xì)胞進(jìn)行MLT處理，其糖原含量增加3倍以上(P<0.05)(圖2)，提示MLT促進(jìn)了高糖高胰島素誘導(dǎo)細(xì)胞的糖原的合成。

2.3 MLT對(duì)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞ROS含量的干預(yù)作用

與正常對(duì)照HepG2細(xì)胞相比，高糖高胰島素誘導(dǎo)的IR組細(xì)胞ROS增加明顯，增加0.42倍(P<0.01)，MLT(1 nmol/L,10 nmol/L)處理后的IR模型細(xì)胞ROS無(wú)顯著性差異。與IR組比較，低高濃度MLT處理組細(xì)胞ROS則顯著減少，分別減少約27%和31%(P<0.01)。低高濃度MLT處理組相比，無(wú)顯著性差異(圖3)。

圖2 MLT對(duì)HepG2細(xì)胞胰島素抵抗模型糖原的影響1：IS；2：IR；3：1 nmol/L MLT；4：10 nmol/L MLT 與IS組相比，**：P<0.01，*：P<0.05；與IR組相比，#：P<0.05，n=3

圖3 MLT對(duì)HepG2細(xì)胞胰島素抵抗模型ROS的影響1：IS；2：IR；3：1 nmol/L MLT；4：10 nmol/L MLT 與IS組相比，*：P<0.01；與IR組相比，#：P<0.01，n=3

3 討 論

肝臟是胰島素發(fā)揮作用的主要靶器官之一，肝細(xì)胞糖代謝的紊亂對(duì)胰島素抵抗的發(fā)生具有十分重要意義。胰島素抵抗時(shí)，糖代謝紊亂，糖攝取能力減弱和肝糖原合成減少，導(dǎo)致血糖升高。本研究通過(guò)高糖高胰島素成功誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生IR，表現(xiàn)為對(duì)葡萄糖攝取減少，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)糖原合成降低，提示高糖高胰島素抑制了細(xì)胞對(duì)葡萄糖的利用能力。

最近研究表明，反應(yīng)活性氧與胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[5-7]。ROS是一類具有強(qiáng)氧化性的含氧物質(zhì)的總稱，主要包括超氧陰離子(O2-)、羥自由基(OH·)、過(guò)氧化氫(H2O2)和脂質(zhì)過(guò)氧基(ROO·)等，它不僅可以直接氧化體內(nèi)生物活性大分子如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及核酸等而使細(xì)胞受損，而且能夠行使第二信使信號(hào)分子功能激活各種應(yīng)激激酶，活化多條氧化應(yīng)激敏感性信號(hào)通路，干擾細(xì)胞胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致胰島素抵抗。在活性氧介導(dǎo)的氧化應(yīng)激狀態(tài)下，3T3-L1脂肪細(xì)胞胰島素受體底物(IRS-1)和(IRS-2)絲氨酸殘基磷酸化，進(jìn)而下調(diào)IRS-1的表達(dá)，導(dǎo)致胰島素抵抗[6]。Evans等[7]發(fā)現(xiàn)高糖所致的ROS是通過(guò)激活A(yù)GES、NF-κB及PKC等途徑導(dǎo)致胰島素抵抗的。Houstis等[8]用地塞米松和TNF-α處理細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生增加，而應(yīng)用抗氧化藥物降低ROS水平后IR得到改善?？梢娗宄钚匝醯暮浚兄诟纳埔葝u素抵抗。本研究發(fā)現(xiàn)高糖高胰島素培養(yǎng)顯著增加了HepG2細(xì)胞ROS含量，推測(cè)ROS是高糖高胰島素誘導(dǎo)發(fā)生胰島素抵抗的重要因素。

褪黑素是大腦松果體腺合成分泌的一種吲哚類神經(jīng)內(nèi)分泌激素，除具有改善睡眠，改善免疫功能以外，還具有強(qiáng)效的抗氧化性，它可以直接清除自由基、減少自由基的生成，提高抗氧化酶的活性等。

本研究發(fā)現(xiàn)褪黑素顯著增加了其胰島素刺激的葡萄糖攝入和糖原的合成，同時(shí)ROS減少了含量。提示MLT通過(guò)降低ROS水平改善氧化應(yīng)激狀態(tài)，從而促進(jìn)了高糖高胰島素培育HepG2細(xì)胞對(duì)葡萄糖的利用率，改善胰島素抵抗。

[1] Slominski RM,Reiter RJ,Schlabritz-Loutsevitch N,et al.Melatonin membrane receptors in peripheral tissues:distribution and functions[J].Mol Cell Endocrinol,2012,351(2):152-166.

[2] She M,Deng X,Guo Z,et al.NEU-P11,a novel melatonin agonist,inhibits weight gain and improves insulin sensitivity in high-fat/high-sucrose-fed rats[J].Pharmacol Res,2009,59(4):248-253.

[3] Agil A,Rosado I,Ruiz R,et al.Melatonin improves glucose homeostasis in young Zucker diabetic fatty rats[J].Pineal Res,2012,52(2):203-210.

[4] Bolisetty S,Jaimes EA.Mitochondria and reactive oxygen species:physiology and pathophysiology[J].Int J Mol Sci,2013,14(3):6306-6344.

[5] Guan L,Feng H,Gong D,et al.Genipin ameliorates age-related insulin resistance through inhibiting hepatic oxidative stress and mitochondrial dysfunction[J].Exp Gerontol,2013,48(12):1387-1394.

[6] Potashnik R,Bloch-Damti A,Bashan N,et al.IRS1 degradation and increased serine phosphorylation cannot predict the degree of metabolic insulin resistance induced by oxidative stress[J].Diabetologia,2003,46(5):639-648.

[7] Evans JL,Goldfine ID,Maddux BA,et al.Are oxidative stress-activated signaling pathways mediators of insulin resistance and beta-cell dysfunction[J]？Diabetes,2003,52(1):1-8.

[8] Houstis N,Rosen ED,Lander ES.Reactive oxygen species have a causal role in multiple forms of insulin resistance[J].Nature,2006,440(7086):944-948.

MelatoninAmelioratesGlucoseMetabolismviaInhibitingROSGenerationinInsulinResistantHepG2CellsInducedbyHighGlucoseandInsulin

SHE Meihua,JIANG Wenyan,ZHANG Yao,et al
(DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,SchoolofPharmaceuticalandBiologicalScience,UniversityofSouthChina,Hengyang,Hunan421001,China)

ObjectiveTo investigate the effects of melatonin on glucose metabolism in high glucose and insulin-induced insulin resistant HepG2 cells.MethodsInsulin resistant HepG2 cells were induced by high glucose and insulin (HGI,25 mmol/L and 1 μmol/L respectively) coculture for 24 h,and then melatonin was added.The uptake of glucose was measured by glucose oxidase method,anthrone method was used to detect the Glycogen synthesis and fluorescence probe was used to detect ROS production.ResultsHGI incubating led to significant decreases in insulin-stimulated glucose uptake and glycogen synthesis in HepG2 cells (P<0.01),but ROS production increased (P<0.01).However,MLT treatment reversed the above state by increasing glucose uptake (P<0.01) and glycogen synthesis (P<0.05),inhibiting the generation of ROS(P<0.01).ConclusionsMLT could improve oxidative stress by inhibiting the production of ROS,and thereby increase glucose utilization and improve insulin sensitivity of insulin resistance HepG2 cells.

MLT; insulin resistance; glucose uptake; glycogen; ROS

2095-1116(2014)05-0433-03

2014-03-06

國(guó)家自然科學(xué)基金(81200590)；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金(20124324120005).

佘美華，博士，副教授，研究方向：糖尿病的分子機(jī)制研究，E-mail：shemhbb@163.com，通信作者尹衛(wèi)東，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：糖尿病的分子機(jī)制研究，E-mail：wdy20042004@126.com.

R587

A

(此文編輯：秦旭平)