蘇素嬌 謝勇 李娜 楊先鋒 梁一池

（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 福州350122）

顯齒蛇葡萄系葡萄科蛇葡萄屬植物（Ampelopsis grossedentata＜Hand-Mazz＞W(wǎng).T.Wang），主要分布在福建、廣東、湖南等省區(qū)。其味甘、淡，性涼，具有清熱解毒、利濕消腫等功效，主治黃疸型肝炎、感冒風(fēng)熱、咽喉腫痛、目赤腫痛、癰腫瘡癤等[1]。國(guó)內(nèi)采用正交旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)或均勻設(shè)計(jì)來(lái)優(yōu)化顯齒蛇葡萄總黃酮的提取工藝，這兩種方法采用線性數(shù)學(xué)模型，具有簡(jiǎn)便、試驗(yàn)次數(shù)少等優(yōu)點(diǎn)，但精度不高[2～5]。我們以顯齒蛇葡萄總黃酮、二氫楊梅素、楊梅苷、楊梅素為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究超聲提取中乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、溶媒比對(duì)顯齒蛇葡萄各指標(biāo)的影響，并用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化其提取工藝，為顯齒蛇葡萄的有效利用及開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 UV-9100紫外可見分光光度計(jì)（北京瑞利分析儀器公司）；THC-10B數(shù)控超聲波提取器（濟(jì)寧天華超聲電子儀器有限公司）；AR2130電子天平（上海奧豪斯儀器有限公司）；DFYDHG-9240電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；Waters e2695高效液相色譜儀（HPLC）包括四元泵、在線脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、2998PDA檢測(cè)器，Empower3工作站（美國(guó)Waters公司）；Sartorius CP225D電子天平（德國(guó)Sartorius公司）；Millipore超純水機(jī)（法國(guó)Millipore公司）。

1.2 試藥 二氫楊梅素對(duì)照品（批號(hào)：12013108）、楊梅素（批號(hào)：12013108）、楊梅苷（批號(hào)：12013108），水為重蒸水，其它試劑為分析純。顯齒蛇葡萄藥材采于福建省高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)園顯齒蛇葡萄基地，由福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定教研室范世明高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定為葡萄科蛇葡萄屬植物顯齒蛇葡萄（Ampelopsis grossedentata＜Hand-Mazz＞W(wǎng).T.Wang）。藥材于40℃下干燥至恒重，粉碎過(guò)40目篩，備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱UltimateXB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）-0.5%甲酸溶液（B）；梯度洗脫，0～50 min，10%～20%A，50～75 min，20%～30%A。流速0.8 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)365 nm，柱溫40℃，進(jìn)樣量 10 μL。

2.2 對(duì)照品及供試品溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取二氫楊梅素、楊梅苷、楊梅素對(duì)照品適量于10 mL量瓶中，加無(wú)水乙醇溶解，稀釋至刻度，分別配制成濃度為7.944 mg/mL、1.009 mg/mL和0.997 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取各對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用無(wú)水乙醇制成每1 mL對(duì)照品溶液含二氫楊梅素3.972 mg、楊梅苷0.1009 mg、楊梅素0.0499 mg的混合對(duì)照品溶液，放置4℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 供試品溶液的制備 稱取顯齒蛇葡萄粉末0.5 g，于100 mL錐形瓶中，量取60%的乙醇溶液15 mL，稱定重量，浸泡30 min后，超聲提取30 min，稱重，補(bǔ)足失重。取上層清液1 mL定容至10 mL即得。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

2.3.1 紫外測(cè)定總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 取對(duì)照品溶液 0.6、0.8、1.2、1.4、1.6、2.0 mL 于 25 mL 瓶中，加1%AlCl3溶液4 mL，用30%乙醇溶液定容至刻度，反應(yīng)10 min，以30%乙醇溶液為空白，在310 nm處測(cè)定吸光度值，以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y=52.92X-0.0026，r=0.9999，結(jié)果表明二氫楊梅素在4.84～16.13 μg/mL內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.3.2 二氫楊梅素、楊梅苷、楊梅素的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)的混合對(duì)照品溶液1、2、4、8、12、15 μL，分別按照“2.1”項(xiàng)的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，以進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程，得二氫楊梅素的回歸方程為：Y=80532X+44994，r=0.9998；得楊梅苷的回歸方程為：Y=2×106X+21700，r=0.9999；得楊梅素的回歸方程為：Y=4×106X+12996，r=0.9999；結(jié)果表明二氫楊梅素、楊梅苷、楊梅素分別在3.972～59.580 μg、0.101～1.514 μg、0.050～0.748 μg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.4 星點(diǎn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)考察的基礎(chǔ)上，確定超聲提取的考察因素為乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、溶媒比，進(jìn)一步采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，因提取次數(shù)為非連續(xù)變量，回歸處理比較困難，暫定為1次。根據(jù)星點(diǎn)設(shè)計(jì)的原理，每個(gè)因素設(shè)5個(gè)水平，用代碼 -α、-1、0、1、α 來(lái)表示（3 因素星點(diǎn)設(shè)計(jì)的α=1.682），代碼所代表的實(shí)際操作物理量見表1，星點(diǎn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表1 星點(diǎn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因素水平

表2 星點(diǎn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 mg/g

2.5 模型擬合 應(yīng)用Design-Expert8.0.4軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行效應(yīng)面試驗(yàn)分析，以總黃酮、二氫楊梅素、楊梅苷、楊梅素四者的總體歸一值（OD）為評(píng)價(jià)指標(biāo)[6]，分別對(duì)各因素進(jìn)行多元線性回歸及二項(xiàng)式方程擬合。多元線性回歸方程：OD=0.69+0.16A+0.19B+0.002C（r=0.6273）；二項(xiàng)式擬合方程：OD=0.85+0.16A+0.19B+0.002C-0.09AB+0.03AC+0.05 BC-0.103A2-0.09B2-0.04C2（r=0.8822）。從擬合方程的相關(guān)系數(shù)可見，多元線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)較低（r=0.6273），表示自變量與因變量之間線性相關(guān)性較差，多元線性回歸擬合度不佳，預(yù)測(cè)性較差，因此該數(shù)學(xué)模型不合適。多元二項(xiàng)式擬合方程相關(guān)系數(shù)較高，擬合效果較好。方程從整體上反映了各因素及其相互作用對(duì)指標(biāo)值的影響。

2.6 方差分析 采用ANOVA分析效應(yīng)面的回歸參數(shù)，由表3可知一次項(xiàng)A、B極顯著，C顯著，二次項(xiàng)A、B極顯著水平，交互項(xiàng)等其余項(xiàng)均不顯著，說(shuō)明各個(gè)具體試驗(yàn)因素與響應(yīng)值都不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。此外，還可以看出各因素對(duì)OD值影響的大小順序?yàn)椋喝苊奖龋˙）＞乙醇濃度（A）＞提取時(shí)間（C）。本試驗(yàn)選用的模型極顯著（P＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），說(shuō)明未知因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果干擾很小，二項(xiàng)式擬合模型為成功模型，實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值基本吻合，有較好的預(yù)測(cè)作用。

表3 擬合回歸方程的方差分析

2.7 工藝條件優(yōu)化與預(yù)測(cè) 根據(jù)二次多項(xiàng)式模型，繪制各考察因素與總體歸一值（OD）之間的等高線圖與三維效應(yīng)曲面圖。根據(jù)各因素水平設(shè)定各因素自變量區(qū)間，效應(yīng)值選擇極大值，得到最佳提取工藝條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)65.82%，溶媒倍量33.88倍，提取時(shí)間32.61 min，此時(shí)OD有最大預(yù)測(cè)值0.9814?？紤]到實(shí)際生產(chǎn)情況，將各因素條件取整確定顯齒蛇葡萄總黃酮最佳提取工藝條件：30倍量65%乙醇超聲提取1次，提取時(shí)間為30 min。

2.8 驗(yàn)證試驗(yàn) 按上述優(yōu)化后的最佳工藝條件提取并測(cè)定顯齒蛇葡萄中總黃酮、二氫楊梅素、楊梅苷、楊梅素的含量，并且進(jìn)行總體歸一化處理，得到平均OD值為0.9762，RSD為1.67%，預(yù)測(cè)值為0.9814。結(jié)果表明，所建立的數(shù)學(xué)模型具有良好的預(yù)測(cè)性，所選工藝條件重現(xiàn)性好。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用超聲提取法提取顯齒蛇葡萄總黃酮、二氫楊梅素、楊梅苷、楊梅素，結(jié)果表明：最佳提取工藝條件為30倍量65%乙醇超聲提取1次，提取時(shí)間為30 min。此條件下，得到各指標(biāo)成分的含量經(jīng)總體歸一化處理后得到的的OD值為0.9762。采用非線性擬合的星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法擬合得出最佳條件，可以很好地解決傳統(tǒng)正交設(shè)計(jì)的不足，從而提高優(yōu)化效果。此法與傳統(tǒng)方法相比較，具有節(jié)約、操作簡(jiǎn)單、省時(shí)等優(yōu)點(diǎn)，得率也高，在中藥提取中具有良好的應(yīng)用前景。

[1]國(guó)家中醫(yī)藥管理局編委會(huì).中華本草[M].第13卷.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1998.4 229

[2]陳業(yè)，羅祖友，向東山.藤茶黃酮類化合物的提取分離與定量方法研究進(jìn)展[J].湖北民族學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2008，26(3)：277-281

[3]剛振坤，馬英麗，吳倫，等.星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化北五味子果實(shí)提取工藝[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17(23)：28-31

[4]劉艷杰，項(xiàng)榮武.星點(diǎn)設(shè)計(jì)效應(yīng)面法在藥學(xué)試驗(yàn)設(shè)計(jì)中的應(yīng)用[J].中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志，2007，24(6)：455-457

[5]吳偉，崔光華，陸彬.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中多指標(biāo)的優(yōu)化：星點(diǎn)設(shè)計(jì)和總評(píng)"歸一值 " 的應(yīng)用[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2000，35(8)：530-533

[6]盧君蓉，傅超美，劉芳，等.星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)選丹參中丹參總酚酸的提取工藝[J].中成藥，2012，34(7)：1 373-1 376