王兆京，張丹丹，陳志偉，陳徹，姚學權，張峰，劉福坤

(1.江蘇省中醫(yī)院消化腫瘤外科，江蘇南京 210029;2.江蘇省省級機關醫(yī)院呼吸科，江蘇南京 210024;3.南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院肝臟移植中心，江蘇南京 210029)

肝血管瘤包括海綿狀血管瘤、硬化性血管瘤、血管內皮細胞瘤和毛細血管瘤4種類型，臨床以海綿狀血管瘤最為多見。肝血管瘤尸檢發(fā)現率為0.4%～7.3%［1］，可發(fā)生于任何年齡段，女性多見，男女比例高達1∶5。肝血管瘤通常為單發(fā)，約10%的患者為多發(fā)血管瘤。大多數患者無癥狀，生長快、瘤體大的肝血管瘤常有右上腹疼痛、腹脹等癥狀［2］，巨大肝血管瘤有時會并有自發(fā)性或創(chuàng)傷性破裂出血，甚至危及生命。

以往研究顯示，各種促血管生成因子如基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)、血管內皮生長因子(VEGF)及其 受 體 (VEGFR1/FLT1、VEGFR2/KDR、VEGFR3/FLT4)在新生兒血管瘤的生長過程中發(fā)揮著重要作用，這些促血管生成因子在增生期表達顯著上調，在消退期表達則明顯降低［3-5］。而在成人肝血管瘤中這些促血管生成因子又發(fā)揮著什么樣的作用尚待進一步研究。本實驗通過收集成人肝血管瘤的臨床標本，初步探討了各種促血管生成因子在肝血管瘤中的表達，旨在為成人肝血管瘤的臨床研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本來源 2010至2012年間共收集成人肝血管瘤標本30例，均來自肝血管瘤肝部分切除術患者;正常肝臟標本15例，均來自肝移植時供體修剪的剩余肝組織。以上標本的獲取均取得倫理委員會的同意，所收集的肝血管瘤標本最終均為術后病理所證實。

1.1.2 試劑 Trizol試劑購自Invitrogen公司，實時反轉錄(RT)試劑盒、PCR分子質量標準物(DL500)購自TaKaRa公司，PCR預混反應體系購自Bioworld生物公司，UltraSensitiveTMS-P超敏試劑盒購自福州邁新生物技術有限公司，抗MMP-9多克隆抗體、抗VEGF多克隆抗體及辣根過氧化酶標記的抗兔二抗均購自Abcam公司，明膠購自Sigma公司，非變性蛋白上樣緩沖液購自Beyotime公司。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR檢測肝血管瘤中 MMP-9、VEGF、FLT1、KDR、FLT4的 mRNA表達 采用 RT-PCR法，MMP-9、VEGF、FLT1、KDR、FLT4 和 GAPDH 引物由Invitrogen公司合成。引物序列見表1。采用Trizol試劑提取總RNA，并檢測RNA的濃度和純度。取RNA 2μl，按照RT-PCR試劑盒進行RT反應獲得cDNA，并置于 -20℃保存?zhèn)溆?。檢測 MMP-9、VEGF、FLT1、KDR、FLT4和GAPDH表達的反應體系共20μl，其中2倍PCR預混反應體系10μl，上游和下游引物各0.5μl，cDNA 1.5μl DEPC處理水7.5μl。PCR反應條件:94℃ 3 min;94℃變性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸45 s，30個循環(huán);最后72℃延伸10 min。PCR反應在Eppendorf PCR擴增儀中進行。PCR反應結束后，取出擴增產物8μl進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 RT-PCR的引物序列

1.2.2 免疫組化方法檢測血管瘤組織中MMP-9和VEGF的表達 標本經10%中性甲醛固定、石蠟包埋，5μm厚連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟、脫水，微波抗原修復，3%H2O2封閉內源性過氧化物酶，封閉液封閉30 min，然后分別滴加兔抗人MMP-9多克隆抗體(工作濃度1∶500)和兔抗人VEGF多克隆抗體(工作濃度1∶500)，4℃孵育過夜。生物素化二抗嚴格按照UltraSensitiveTMS-P超敏試劑盒說明書進行。顯微鏡下控制DAB顯色，蘇木素復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡檢。陽性對照為肝細胞肝癌組織［6］。

1.2.3 蛋白質印跡法檢測肝組織中MMP-9的表達取凍存肝血管瘤組織各50 mg分別進行裂解、勻漿、提取組織蛋白，測定蛋白濃度后加入適量蛋白上樣緩沖液，100℃變性10 min，每個泳道以40μg蛋白量上樣，以12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后電轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入兔抗人MMP-9多克隆抗體(1∶1 500)，4℃孵育過夜，TBST洗 4次，每次5 min，然后加入辣根過氧化酶標記的抗兔二抗(1∶2 500)，37℃孵育1 h，TBST洗4次，每次5 min，然后ECL顯色，壓片曝光。

1.2.4 明膠酶譜法檢測肝血管瘤組織中MMP-9和pro-MMP9的活性變化 -70℃保存的肝血管瘤組織標本放入冰盒中的玻璃勻漿器內，加入緩沖液進行勻漿提取(緩沖液為 50 mmol·L-1Tris-HCl，pH 7.3，100 mmol·L-1NaCl，1%Triton-100，0.05%Brij-35)，4 ℃離心(12 000 r·min-1，10 min)，留取上清提取物。將提取的組織勻漿液中加入適量5倍非變性電泳緩沖液于含有0.1%明膠底物的10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳2 h，用2.5%Triton-100室溫洗滌2次，每次30 min，然后轉移至底物消化緩沖液中(10 mmol·L-1Tris-Base，40 mmol· L-1Tris-Cl，0.2 mol·L-1NaCl，5 mmol·L-1CaCl2，0.02%Brij-35，pH 7.6)，37 ℃孵育 24 h，0.25% 考馬斯亮藍染色30 min，洗脫液內脫色，直至出現清晰的消化條帶。電泳結果進行拍照分析。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學分析。數據以均數±標準差表示，兩樣本均數的比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 肝血管瘤中 MMP-9、VEGF、FLT1、KDR、FLT4的mRNA表達

RT-PCR檢測成人肝血管瘤患者和正常人兩組間MMP-9、VEGF、FLT1、KDR、FLT4 的 mRNA 表達，結果顯示，肝血管瘤中MMP-9 mRNA的表達量明顯升高，而正常組表達較低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。但測定VEGF、FLT1、KDR、FLT4的mRNA表達未發(fā)現明顯差異(圖1)。

2.2 免疫組化法檢測血管瘤組織中MMP-9和VEGF的表達

免疫組化法檢測發(fā)現，MMP-9在血管瘤中的陽性表達率為90%(27/30)，而在正常組織中陽性表達率為13.3%(2/15)。而且MMP-9的蛋白陽性表達主要位于血管瘤的間質細胞和內皮細胞中(圖2)。同時我們也檢測了VEGF在兩組中的表達，結果發(fā)現VEGF在兩者中表達均較低，未發(fā)現明顯差異(數據文章中未列出)。

圖1 MMP-9、VEGF、FLT1、KDR 和 FLT4在成人肝血管瘤中的mRNA表達 (a P＜0.05)

2.3 血管瘤組織中MMP-9的蛋白表達及其活性變化

MMP-9的蛋白表達與MMP-9 mRNA的表達基本一致。在正常肝組織中MMP-9的表達很少，膜上的顯色條帶很淺，肉眼幾乎不能辨認，通過計算機成像分析才能檢測到。但在血管瘤組織中MMP-9的表達明顯增強(圖3)，兩者比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。此外，明膠酶譜法檢測發(fā)現肝血管瘤組織中MMP-9和pro-MMP9的活性較正常肝組織明顯增強。從上到下觀察得到的藍色背景凝膠塊，可以清楚地看到兩條帶，與分子質量標準物對照，其分子質量分別約在92 kD和82 kD，結果可見明顯差異(圖3)。

3 討 論

雖然肝血管瘤是一種常見肝疾病，但是其確切的病理發(fā)生機制至今尚不清楚。一般認為血管瘤是一種異常的血管增生，血管調節(jié)因子在其中發(fā)揮了重要作用［7-8］。MMP-9與VEGF是重要的促血管生成因子，它們在血管內皮細胞增殖及新生血管形成中發(fā)揮著重要作用。以往的研究發(fā)現，新生兒血管瘤在增生期MMP-9和VEGF的表達顯著增高，而在消退期其表達顯著下調［3］。但成人肝血管瘤的生長特征與新生兒血管瘤完全不同。新生兒血管瘤通常在其出生后的數周內出現，它的生長分為增生期、消退期和消退后期3期。增生期血管瘤生長迅速，持續(xù)時間可長達12個月，緊接著進入消退期，此時血管瘤的生長開始減慢，持續(xù)時間5～7年，最終進入消退后期，此時血管瘤的生長幾乎完全停止［3，9］。約有50%的患者瘤體在5歲時可完全消退。而成人肝血管瘤多見于40～50歲成人，它的生長則表現為持續(xù)性、緩慢性，其生長特點與新生兒血管瘤完全不同。這表明在成人肝血管瘤的生長過程中可能存在著與新生兒血管瘤不同的病理發(fā)生機制。在本實驗中，我們檢測到在成人肝血管瘤中MMP-9的mRNA、蛋白表達及其活性明顯高于正常組織。而測定 VEGF及其受體 FLT1、KDR、FLT4的mRNA、蛋白表達未發(fā)現明顯差異。

圖2 MMP-9在成人肝血肝瘤中的表達及分布 ×200 A為肝細胞肝癌做陽性對照;B為正常肝組織;C為成人肝血管瘤組織

圖3 MMP-9在成人肝血肝瘤中的蛋白表達及其活性變化 A、B為蛋白質印跡法檢測的蛋白表達;C為明膠酶譜法測定的MMP-9和pro-MMP9的活性變化(a P＜0.05)

血管瘤的生長依賴于新生血管的形成［10］。在新生血管生成過程中，血管內皮細胞主要以生芽方式生長，這一過程要經過細胞外基質的降解、細胞分裂、遷移并侵入細胞外基質，才能形成毛細血管樣結構［11］。而細胞外基質的降解是血管生成的關鍵一步［12］。MMP-9是92 kD的明膠酶B，能有效地降解基底膜和細胞外基質，在此過程中，MMP-9還可以誘導血管內皮細胞遷移和血管的塑形，并促進新生血管的生成［13-14］。本研究證實成人肝血管瘤組織中MMP-9的蛋白表達及其活性均明顯增高，因此MMP-9在血管瘤組織中高表達可能與血管瘤中基質降解重塑及內皮細胞遷移和管狀結構形成密切相關，可能是成人肝血管瘤持續(xù)生長的原因，如能阻斷MMP-9的作用，有望能抑制肝血管瘤的增生。

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