王醒，江筱莉，周昱薇，陳明祺，呂海，顧寧

(1.東南大學(xué)生物科學(xué)與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，江蘇南京 210009;2.江蘇省中醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，江蘇南京 210029)

在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，納米銀的抗菌性能已為人們逐漸認(rèn)識(shí)和使用。納米銀抗菌譜廣，對(duì)G+和G-菌均有良好的抑制作用，同時(shí)，納米銀還可以抗病毒和抗其它真核微生物［1-3］。與臨床上其他抗菌劑比較，納米銀不僅是一種廣譜抗菌劑，微量即可發(fā)揮殺菌作用，而且它不同于抗生素，不會(huì)產(chǎn)生耐藥性，且效力持久，是一種長(zhǎng)效的抗菌劑［4-6］。但目前有關(guān)納米銀生物安全性評(píng)價(jià)的研究尚不多見(jiàn)。開(kāi)展納米銀在動(dòng)物體內(nèi)的安全性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)，對(duì)促進(jìn)納米銀材料抗菌導(dǎo)管進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段具有重要意義。本研究通過(guò)對(duì)健康小鼠一次性經(jīng)口灌胃給藥行最大劑量耐受實(shí)驗(yàn)，為納米銀的生物安全應(yīng)用提供一定的支持和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

ICR小鼠40只，體重18～22 g，由揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào):SCXK(蘇)2012-0004。納米銀凍干粉由東南大學(xué)生物科學(xué)與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，粒徑15～30 nm;臨床成人日用量為1.67μg·kg-1。實(shí)驗(yàn)條件:室溫［(20±2)℃］，濕度55% ～65%，光照適度，通風(fēng)潔凈良好。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 將40只ICR小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組各20只。實(shí)驗(yàn)組給予納米銀凍干粉6 mg·kg-1，對(duì)照組給予等量生理鹽水(NS)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法 所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前正常飼養(yǎng)，給藥前禁食(不禁水)12 h，實(shí)驗(yàn)組用150μg·ml-1納米銀(最大濃度)灌胃給藥，按0.4 ml·(10 g鼠重)-1灌胃1次。全價(jià)營(yíng)養(yǎng)顆粒飼料飼養(yǎng)2周。

1.2.3 觀察指標(biāo) 給藥后觀察2周內(nèi)小鼠行為、外觀、進(jìn)食、排泄物、有無(wú)死亡情況等。2周后處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行尸檢，肉眼觀察各主要臟器(心、肝、脾、肺、腎)有無(wú)異常改變，并在電鏡下觀察有無(wú)損傷情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 兩組小鼠一般情況

納米銀凍干粉按6 mg·kg-1劑量給實(shí)驗(yàn)組小鼠經(jīng)口灌胃后，未觀察到動(dòng)物出現(xiàn)不良反應(yīng)。小鼠活動(dòng)未見(jiàn)明顯改變，行為無(wú)異常，安靜，無(wú)明顯煩躁;皮毛干燥整潔，尿液及糞便正常。攝食量、體重等與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，表1)。兩組動(dòng)物2周內(nèi)均未發(fā)生死亡。

表1 納米銀灌胃最大給藥量對(duì)小鼠一般特征的影響±s)Tab 1 General characteristics of mice after intragastric administration with the maximum dose of nano silver lyophilized powder±s)

表1 納米銀灌胃最大給藥量對(duì)小鼠一般特征的影響±s)Tab 1 General characteristics of mice after intragastric administration with the maximum dose of nano silver lyophilized powder±s)

組 別 劑量/g·kg-1 n 實(shí)驗(yàn)前體重/g 攝食量/g·(10 g)-1實(shí)驗(yàn)?zāi)w重/g 攝食量/g·(10 g)-1對(duì)照組 等量NS 20 18.5±1.60 2.57±0.24 27.7±2.74 1.76±0.21實(shí)驗(yàn)組 40 20 19.5±1.41 2.68±0.34 27.4±3.06 1.90±0.17

2.2 主要臟器病理改變情況比較

給藥2周后處死兩組小鼠，肉眼觀察兩組小鼠各內(nèi)臟(心、肝、脾、肺、腎)外形、顏色、質(zhì)地、大小等均未見(jiàn)異常改變。HE染色后電鏡下觀察兩組小鼠主要臟器切片形態(tài)，顯示兩組心、腎、肺、肝、脾均形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，無(wú)明顯細(xì)胞凋亡、變性，無(wú)納米銀顆粒沉積(圖1)。

3 討 論

隨著納米銀材料在醫(yī)療領(lǐng)域應(yīng)用的日益廣泛，納米銀的生物安全性問(wèn)題愈加值得關(guān)注。納米銀可通過(guò)呼吸道、消化道、皮膚暴露等多種途徑進(jìn)入人體內(nèi)，與機(jī)體相互作用后所產(chǎn)生物質(zhì)的化學(xué)特性、生物活性與化學(xué)成分相同的常規(guī)物質(zhì)有很大不同，具有潛在的毒性效應(yīng)，并成為一些疾病的誘因［7］。以往研究認(rèn)為，銀尚屬于相對(duì)安全的抗菌材料。銀的常規(guī)毒性表現(xiàn)為銀中毒，但一般只有當(dāng)患者存在大面積開(kāi)放性創(chuàng)傷，且長(zhǎng)期使用大劑量的銀離子抗菌劑時(shí)才會(huì)出現(xiàn)銀離子的蓄積中毒［8］。有關(guān)納米銀的體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)納米銀的濃度和蓄積量達(dá)到一定程度，其對(duì)細(xì)胞的形貌和活性都會(huì)產(chǎn)生一定的影響，并且隨著濃度增加而毒性作用進(jìn)一步增強(qiáng)［9-11］。Asharani等［12］對(duì)納米銀的細(xì)胞毒理和基因毒理進(jìn)行了研究，并對(duì)納米銀的毒理機(jī)制進(jìn)行了較為詳細(xì)的探討，發(fā)現(xiàn):納米銀可以改變細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞的生存能力、代謝活動(dòng)、氧化過(guò)程;納米銀可以減少細(xì)胞中ATP的量，造成線粒體的損害，增加活性氧的產(chǎn)物。Asharani等［13］通過(guò)斑馬魚(yú)模型進(jìn)一步研究了納米銀在活體中的毒性:魚(yú)的精胚和納米銀共孵育一段時(shí)間后可發(fā)現(xiàn)，納米銀吸附于一些重要器官，如腦部;隨著魚(yú)的生長(zhǎng)可進(jìn)一步引起后期的發(fā)育缺陷。該研究也在一定程度上證實(shí)了納米銀在活體的沉積吸附方式，以及其如何與生物分子相互作用(如蛋白和DNA)。

圖1 電鏡下兩組主要臟器病理形態(tài) 4×10 A1～A5為對(duì)照組(依次為心、腎、肺、肝、脾)，B1～B5為實(shí)驗(yàn)組(依次為心、腎、肺、肝、脾)Fig 1 Comparison of major organs pathological form(4 ×10)A1-A5 for the control group(heart，kidney，lung，liver，spleen)，B1-B5 for the experimental group(heart，kidney，lung，liver，spleen)

本研究中，納米銀凍干粉經(jīng)口灌胃給藥后小鼠未能測(cè)出LD50，小鼠經(jīng)口最大給藥量、最大容積的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:20只小鼠給藥后無(wú)明顯毒性反應(yīng)，2周內(nèi)亦無(wú)死亡。因此，納米銀經(jīng)口給藥的小鼠最大給藥量為6 mg·kg-1，如按臨床成人1日口服1.67μg·kg-1計(jì)算，則該藥的小鼠1日灌胃藥量為臨床成人1日口服量的3 592倍。

本實(shí)驗(yàn)肉眼觀察了兩組小鼠主要臟器外形、顏色、質(zhì)地、大小等，均未見(jiàn)異常改變;HE染色后電鏡下觀察，兩組小鼠主要臟器切片均形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，無(wú)明顯細(xì)胞凋亡、變性，這與目前已進(jìn)行的大鼠28 d經(jīng)氣道和經(jīng)口毒性實(shí)驗(yàn)取得的結(jié)果［14-15］相似。Ji等［14］給大鼠吸入納米銀粒子(4～80 nm)，結(jié)果顯示，大鼠在28 d的體重、器官重量均未發(fā)生顯著變化，亦未發(fā)現(xiàn)明顯臟器毒性。Kim等［15］用納米銀顆粒(60 nm)進(jìn)行了大鼠經(jīng)口毒性實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)各組大鼠28 d體重?zé)o明顯變化，未見(jiàn)明顯臟器損害情況，僅在高劑量(300 mg·kg-1)時(shí)引起輕度肝損，而該劑量為本實(shí)驗(yàn)小鼠經(jīng)口給藥劑量的50倍，表明該劑量的納米銀是相對(duì)安全的。

然而，納米銀是通過(guò)其釋放的銀離子還是自身通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞后與其它亞細(xì)胞器反應(yīng)而產(chǎn)生毒性，目前尚未定論。在設(shè)計(jì)高效抗菌的納米銀抗菌材料的同時(shí)，因其要求抗菌效果實(shí)現(xiàn)持久緩慢的特點(diǎn)，更需要注重納米銀的安全性。所以，進(jìn)一步深入開(kāi)展納米銀生物安全性方面的研究，有助于推進(jìn)醫(yī)用納米銀抗菌材料的推廣應(yīng)用。

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