王永娟， 朱善元， 王 岑， 左偉勇

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點實驗室，江蘇 泰州225300)

雞傳染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV)的免疫主要通過疫苗進(jìn)行，但由于活疫苗免疫能導(dǎo)致雞法氏囊的凋亡和毒力增強而影響免疫效果［1-2］。VP2 是IBDV 病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，在病毒包裝、細(xì)胞吸附、免疫應(yīng)答過程中都起重要作用［3-5］，所以目前的疫苗相關(guān)的研究主要針對VP2 蛋白質(zhì)。miRNA 作為小RNA 的一種已被證實能抑制病毒基因的表達(dá)［6-7］。禽腺聯(lián)病毒(Avian adeno-associated virus，AAAV)具有與哺乳動物AAV類似的潛伏感染特性和相似的基因組結(jié)構(gòu)，并被證明能在禽源細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)外源基因［8-9］，具有無致病性、免疫原性低、細(xì)胞感染譜廣和外源基因表達(dá)穩(wěn)定持續(xù)等優(yōu)點，被認(rèn)為是一種很有應(yīng)用前景的基因轉(zhuǎn)移載體［10］，已有學(xué)者成功構(gòu)建了AAAV 基因轉(zhuǎn)移載體和三質(zhì)粒轉(zhuǎn)染制備rAAAV 方法，獲得了滴度較高且能在雞體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)人組織激肽釋放酶的rAAAV［11］。本試驗在前期研究基礎(chǔ)上，構(gòu)建vp2與vp1基因特異miRNA 重組禽腺聯(lián)病毒轉(zhuǎn)移載體，制備具有抑制IBDV 復(fù)制能力的rAAAV，為探索雞傳染性法氏囊病IBD 防制新途徑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 酶及主要試劑 各種酶及Marker 購自寶生物(大連)公司;Trizol、Wizard DNA Clean-up System購自美國Promega 公司;DMEM 培養(yǎng)基購自美國GIBCO 公司;小牛血清(NBS)購自中美合資蘭州民海生物工程有限公司;丁酸鈉、多聚乙烯亞胺(PEI)購自SIGMA 公司;其他試劑為國產(chǎn)分析純級。

1.1.2 主要生物材料 miRNA 表達(dá)載體pRFPRNAiC 購于英國Roslin 研究所;DF-1 細(xì)胞系、中強毒力IBDV Lurkert 疫苗株由秦愛建教授提供;IBDV LYG 株和YEZ 株由揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院微生物實驗室惠贈，含Ad5 E1基因的AAV-293 細(xì)胞，pHelper購自Stratagene 公司。pRFPRNAmivp2E、pRFPRNAmivp2con、pCR-AAAV、pcDNA-ARC 由揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院微生物實驗室提供［6，12-13］;DH5α 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞由江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點實驗室保存。

1.1.3 儀器 倒置熒光顯微鏡為德國Leica 公司產(chǎn)品;全波長分光光度計為美國NanoDrop 公司產(chǎn)品;透射電子顯微鏡為荷蘭Philips 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1vp1特異miRNA 表達(dá)載體的構(gòu)建 參照文獻(xiàn)報道方法設(shè)計vp1特異miRNA 序列［6］，合成的序列分別為5'-GAGAGGTGCTGCTGAGCGATACCCAGAAG TCAAGAACTAGTGAAGCCACAGATGTA-3' 和5'-ATTCACCACCACTAGGCAGTACCCAGAAGTCAAGAACT ACATCTGTGGCTTCACT-3'，兩序列退火形成shRNA并克隆至pRFPRNAiC 以制備pRFPRNAmivp1。

1.2.2 AAAV 轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建 根據(jù)AAAV 基因組DNA 酶切圖譜，PmlⅠ與BsmB Ⅰ雙酶切pCRAAAV 質(zhì)粒，回收含AAAV 左右ITR 的約4 100 bp載體片段(對應(yīng)質(zhì)粒命名為pAITR)，補平;SalⅠ和BamH Ⅰ雙酶切pRFPRNAmivp2E、pRFPRNAmivp1和pRFPRNAmivp2con 后回收含紅色熒光蛋白質(zhì)(Red fluorescent protein，RFP)表達(dá)盒和miRNA 表達(dá)框盒的約3 200 bp 片段，補平后與帶ITR 的片段連接，最終擬獲得重組質(zhì)粒pAITR-RFPmivp2E、pAITR-RFPmivp2con 和pAITR-RFPmivp1。

SalⅠ和DraⅠ雙酶切pRFPRNAiC 質(zhì)粒，回收約2 100 bp 片段，補平后與pAITR 連接，最終擬構(gòu)建僅表達(dá)RFP 的pAITR-RFP。

1.2.3 rAAAV 的生產(chǎn)與純化 將AAAV 轉(zhuǎn)移載體pAITR-RFP-mivp2E、pAITR-RFP-mivp1、pAITR-RFPmivp2con、pAITR-RFP 分別與AAAV 包裝載體pcDNA-ARC 和腺病毒輔助載體pHelper 組成三質(zhì)粒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，參考文獻(xiàn)報道的磷酸鈣沉淀法［14］共轉(zhuǎn)染AAV-293 細(xì)胞，72 h 后收獲細(xì)胞，采取-20 ℃乙醇浴10 min→37 ℃水浴10 min 的方法反復(fù)凍融4 次，10 000 r/min 離心10 min，收集的上清即為rAAAV，其純化與濃縮方法參照文獻(xiàn)報道的進(jìn)行［14］，最終濃縮10 000 倍后病毒液-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 rAAAV 感染性滴度的測定 按照參考文獻(xiàn)方法［11］，將DF-1 細(xì)胞按1 孔1×104細(xì)胞的密度接種96 孔培養(yǎng)板，在細(xì)胞生長良好時感染倍比稀釋好的純化后rAAAV，每孔接種50 μl(n=2)，并加終濃度為10 mmol/L 的丁酸鈉。37 ℃、5% CO2孵育48 h 后，在熒光顯微鏡下計數(shù)各孔的紅色熒光陽性細(xì)胞數(shù)，并按TU= 1 ml 中RFP 陽性細(xì)胞數(shù)×稀釋倍數(shù)，計算感染性rAAAV 的滴度(TU)。

1.2.5 rAAAV 的鑒定

1.2.5.1 電鏡觀察 取初步純化的rAAAV 懸液滴于有支持膜的銅網(wǎng)上，10 min 后用干凈濾紙從網(wǎng)邊吸去液體，另滴加3%磷鎢酸(pH 6.0)染色2 ～3 min，之后吸去液體立即進(jìn)行透射電鏡觀察。

1.2.5.2 病毒感染性試驗 參考文獻(xiàn)報道的方法用 未 純 化 的 rAAAV-RFPmiVP2E、rAAAV-RFPmiVP1、rAAAV-RFPmiVP2con 和rAAAV-RFP 分別感染DF-1 細(xì)胞［14］，37 ℃、5% CO2孵育48 h 后，直接在熒光顯微鏡下觀察RFP 的表達(dá)。

1.2.6 miRNA 表達(dá)的檢測 設(shè)計miRNA 表達(dá)盒的序列上下游引物: 5'-TCCCTCGACCTGCAGC CCAAGCTTGCGGCCGCGACAACACAAGCATCGAGCCC-3'和5'-CCGATTCATTAATGCAGCGGATCCATCGATAAAAAAGCTTACCGT -3'，收獲rAAAV 感染48 h 后RFP 陽性孔細(xì)胞，按Trizol 試劑說明書提取細(xì)胞總RNA，以提取的RNA 為模板，用RT-PCR 檢測感染細(xì)胞中miRNA 的表達(dá)。10 μl RT 體系為:4 μg 總

RNA，10 pmol Oligo(dT)18，40 U RNasin，10 mmol dNTPs 和200 U MMLV 反轉(zhuǎn)錄酶，反應(yīng)條件為37 ℃、1 h。50 μl PCR 反應(yīng)體系為:2 μl RT 產(chǎn)物，15 pmol正、反向引物，5 U DNA polymerase。30 次循環(huán)PCR程序為:94 ℃45 s(第一次循環(huán)為4 min)，69 ℃45 s，72 ℃1 min(最后一次循環(huán)為10 min)。反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.7 IBDV 野毒株細(xì)胞適應(yīng)毒培養(yǎng) 按常規(guī)方法分別感染IBDV LYG 株和YEZ 株于DF-1 細(xì)胞，盲傳至細(xì)胞出現(xiàn)明顯肉眼病變時，以Karber 法［15］計算病毒TCID50。

1.2.8 miRNA 對病毒抑制效率的檢測

1.2.8.1TCID50測定 將DF-1 細(xì)胞按1 孔1×105細(xì)胞的密度接種24 孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)至細(xì)胞密度約為80%時按1 個細(xì)胞10 個TU 的劑量接種rAAAV，1 孔500 μl。在感染后約48 h 出現(xiàn)熒光陽性細(xì)胞時，參考文獻(xiàn)報道［7］的0.001TCID50/TU 的劑量和方法，分別用1 個同源株(Lukert)和2 個異源株(LYG 和YEZ)IBDV 感染(n=3)。在感染后24 h、48 h、72 h、96 h時，分別取100 μl 細(xì)胞上清液進(jìn)行IBDVTCID50測定，以rAAAV-RFP 轉(zhuǎn)導(dǎo)、IBDV 感染細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的TCID50為參考，計算rAAAV 介導(dǎo)的miVP2E、miVP1 和miVP2con 對IBDV 復(fù)制的抑制作用。

1.2.8.2 RT-PCR 檢測 在IBDV 感染后96 h，收集各孔細(xì)胞并提取細(xì)胞及病毒核酸。以O(shè)ligo(dT)18為引物進(jìn)行vp2基因的半定量RT-PCR 反應(yīng)，檢測vp2基因的表達(dá)(內(nèi)參為β-actin基因)，PCR 結(jié)束后，瓊脂糖凝膠電泳、EB 染色，用ND-1000分光光度計對目的條帶及內(nèi)參條帶進(jìn)行灰度掃描，根據(jù)rAAAV 轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中vp2擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化判斷miRNA 對IBDV 基因表達(dá)的抑制作用。

2 結(jié)果

2.1 AAAV 轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建與鑒定

在前期研究基礎(chǔ)上，構(gòu)建了IBDVvp1基因特異miRNA 表達(dá)載體pRFPRNAmivp1(圖略)。然后利用重組DNA 技術(shù)，完成了miRNA-RFP 表達(dá)盒與AAAV ITR 的拼接，形成AAAV 轉(zhuǎn)移載體，這些轉(zhuǎn)移載體經(jīng)EcoR Ⅰ消化、瓊脂糖凝膠電泳分離，可見預(yù)期的約3 800 bp、2 500 bp、1 450 bp 條帶，經(jīng)鑒定正確的載體分別命名為pAITR-RFPmivp2E、pAITRRFPmivp2con 和pAITR-RFPmivp1(圖1)。同時，完成了對照載體pAITR-RFP 的構(gòu)建，該載體在EcoRⅠ消化后，電泳可見預(yù)期的約3 800 bp、2 500 bp、400 bp 條帶(圖2)。

圖1 pAITR-RFPmivp2E 酶切鑒定Fig.1 Identification of pAITR-RFPmivp2E

2.2 rAAAV 的產(chǎn)生與感染性滴度測定

通過質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的方法獲得rAAAV，分別用純化后稀釋的重組病毒rAAAV-RFPmiVP2E、rAAAVRFPmiVP1、rAAAV-RFPmiVP2con 和rAAAV-RFP 感染DF-1 細(xì)胞，在感染后48 h，可見紅色熒光陽性細(xì)胞。根據(jù)每孔細(xì)胞中熒光陽性細(xì)胞數(shù)計算重組病毒感染滴度，結(jié)果純化、濃縮后的 rAAAV-RFPmiVP2E、rAAAV-RFPmiVP2con 和 rAAAV-RFPmiVP1 的感染性滴度均可達(dá)到5×108TU/ml，rAAAV-RFP 的感染性滴度為6×108TU/ml。

圖2 pAITR-RFP 酶切鑒定圖Fig.2 Identification of pAITR-RFP

2.3 rAAAV 的鑒定

2.3.1 電鏡觀察結(jié)果 以rAAAV-RFPmiVP2E 為代表，將純化和濃縮后的rAAAV 進(jìn)行透射電子顯微鏡觀察，可見典型的AAAV 顆粒，病毒顆粒的直徑約為20 nm(圖3)。

圖3 rAAAV-RFPmiVP2E 的電鏡照片(×65000)Fig.3 Electronic microscopic examination of rAAAV-RFPmiVP2E (×65000)

2.3.2 病毒感染性試驗 在DF-1 細(xì)胞被純化的rAAAV 感染后24 h，熒光顯微鏡下可觀察到帶紅色熒光的細(xì)胞，感染后48 h 熒光陽性細(xì)胞數(shù)量最多，強度最強，但熒光強度明顯弱于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞(圖4)，這一紅色熒光可維持近14 d，此時細(xì)胞出現(xiàn)衰老死亡。

2.4 rAAAV 感染細(xì)胞中miRNA 的表達(dá)檢測

在rAAAV 感染后48 h，收集RFP 陽性孔細(xì)胞提取總RNA，以針對miRNA 表達(dá)盒上、下游序列引物進(jìn)行RT-PCR 檢測，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳分離后，可見預(yù)期1 000 bp 左右特異條帶，而不含miRNA 表達(dá)盒的rAAAV-RFP 對照病毒無此條帶。以rAAAVRFPmiVP2E 為代表的感染細(xì)胞的檢測結(jié)果如圖5。

圖4 rAAAV-RFPmiVP2E 感染細(xì)胞的熒光觀察Fig.4 Fluorescence observation of rAAAV-RFPmiVP2E infecting DF-1 cells

圖5 RT-PCR 檢測rAAAV-RFPmiVP2E 感染細(xì)胞中miRNA表達(dá)Fig.5 Detection of miRNA expression in rAAAV-RFPmiVP2E infecting DF-1 cells by RT-PCR

2.5 miRNA 對同源IBDV 復(fù)制的抑制作用

2.5.1TCID50檢測 DF-1 細(xì)胞在rAAAV 轉(zhuǎn)導(dǎo)后2 d 感染同源毒株Lukert 株，之后每隔24 h 收取細(xì)胞上清液測定病毒TCID50。從圖6 可以看出，與rAAAVRFPmiVP2con 和rAAAV-RFP 相比，經(jīng)rAAAV-RFPmiVP2E 和rAAAV-RFPmiVP1 轉(zhuǎn)導(dǎo)24 h 后，病毒TCID50均下降，這種抑制作用至少維持96 h，針對vp2和vp1基因的miRNA 的抑制率無顯著差異。

2.5.2 半定量RT-PCR 在檢測細(xì)胞上清液中IBDV 的同時，收獲感染細(xì)胞提取總RNA，以β-actin基因為內(nèi)參，在同等條件下進(jìn)行vp2基因的半定量RT-PCR 檢測。IBDV 感染后96 h 的檢測結(jié)果(圖7)顯示，與對照病毒 rAAAV-RFPmiVP2con 和rAAAV-RFP 轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞相比，rAAAV-RFPmiVP2E 和rAAAV-RFPmiVP1 表達(dá)的miRNA 對同源株IBDVvp2基因表達(dá)的抑制率分別為85.2%和89.6%。

圖6 rAAAV 表達(dá)的miRNA 對同源株IBDV 復(fù)制的抑制作用Fig.6 The inhibitory effect of rAAAV-delivered miRNAs on homologous IBDV replication revealed by TCID50

圖7 rAAAV 表達(dá)的miRNA 對同源株IBDV 基因表達(dá)的抑制作用Fig.7 The inhibitory effect of rAAAV-delivered miRNAs on homologous IBDV gene expression detected by semiquantitative RT-PCR

2.6 miRNA 對異源IBDV 復(fù)制的抑制作用

DF-1 細(xì)胞同樣在rAAAV 轉(zhuǎn)導(dǎo)后2 d 感染異源毒株YEZ 株和LYG 株，在感染后96 h，檢測細(xì)胞上清液中的病毒TCID50，結(jié)果(圖8)顯示，與rAAAVRFPmiVP2con 和 rAAAV-RFP 轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞相比，rAAAV-RFPmiVP2E 和rAAAV-RFPmiVP1 轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中YEZ 株和LYG 株IBDVTCID50均下降，其中rAAAV-RFPmiVP2E 轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中LYG 株TCID50下降幅度低于rAAAV-RFPmiVP1。

圖8 rAAAV 表達(dá)的miRNA 對異源株IBDV 復(fù)制的抑制作用Fig.8 The inhibitory effect of rAAAV-delivered miRNAs on heterologous IBDV replication detected by TCID50

3 討論

為了構(gòu)建表達(dá)miRNA 的重組AAAV，本研究將miRNA 表達(dá)盒與RFP 表達(dá)盒一起插入AAAV 轉(zhuǎn)移載體，將獲得的重組載體pAITR-RFP、pAITR-RFPmivp2E、pAITR-RFPmivp2von 和pAITR-RFPmivp1與AAAV 包裝載體和腺病毒輔助載體組成三質(zhì)粒系統(tǒng)，通過共轉(zhuǎn)染AAV-293 細(xì)胞獲得了表達(dá)抑制性miRNA的 rAAAV-RFPmiVP2E 和 rAAAV-RFPmiVP1、rAAAV-RFPmiVP2con(表 達(dá) miRNA 對 照)以 及rAAAV-RFP(不表達(dá)miRNA 對照)。通過用PCR 檢測、電鏡觀察和細(xì)胞感染等試驗證明，重組病毒不僅具有典型的AAAV 形態(tài)結(jié)構(gòu)，基因組中含miRNA 表達(dá)盒，而且能感染DF-1 細(xì)胞和表達(dá)報告基因。就重組病毒的滴度而言，同時含miRNA 和RFP 表達(dá)盒的rAAAV-RFPmiVP2E、rAAAV-RFPmiVP1 和 rAAAVRFPmiVP2con 低于僅含RFP 表達(dá)盒的rAAAV-RFP，這可能與AAAV 的包裝容量(≤4 500 bp)有關(guān)［11］，提示如將RFP 報告基因刪除，有可能進(jìn)一步提高rAAAV 的包裝效率和病毒滴度。

AAAV 是一種復(fù)制缺陷型病毒，需要輔助病毒的參與才能復(fù)制和產(chǎn)生子代病毒顆粒。常用的重組AAAV 制備方法主要有2 種，一是將含外源基因表達(dá)盒和AAAV 反向末端重復(fù)序列的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒與含AAAV 的復(fù)制蛋白(Rep)和(或)外殼蛋白(Cap)基因的輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，經(jīng)腺病毒等輔助病毒感染后獲得重組病毒;二是所謂的三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染法，即以含腺病毒E2A、E4和VA基因的質(zhì)粒代替輔助病毒功能［16］。相比之下，三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染法可簡化重組病毒的純化，避免輔助病毒污染，并能減少野生型AAAV 的產(chǎn)生［17］，因此我們采用三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染法制備重組AAAV。

AAAV 是一種單鏈DNA 病毒，當(dāng)AAAV 進(jìn)入細(xì)胞后，病毒顆粒轉(zhuǎn)運到細(xì)胞核內(nèi)，通過基因組的正、負(fù)鏈退火或單鏈復(fù)制成雙鏈后，才能進(jìn)行病毒基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達(dá)，這一過程比較緩慢，所以在體外培養(yǎng)的細(xì)胞中，AAAV 載體介導(dǎo)的基因表達(dá)時間較質(zhì)粒轉(zhuǎn)染滯后。輔助病毒或者其他的一些化學(xué)因素如喜樹堿、丁酸鈉等可以加速這一過程的發(fā)生，從而促進(jìn)外源基因的表達(dá)［11］。

本研究通過細(xì)胞感染試驗研究rAAAV 表達(dá)的miRNA 對不同毒株IBDV 復(fù)制的抑制效率。結(jié)果顯示，在IBDV 感染96 h 時間內(nèi)，針對vp1和vp2基因的miRNA 對同源Lukert 株IBDV 的抑制作用均較強，可使TCID50下降，明顯高于重組質(zhì)粒表達(dá)的相同miRNA 的抑制效率［6］，可能原因是rAAAV 的感染效率高于質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率。對2 個異源IBDV 毒株而言，針對vp2基因的miVP2E 和針對vp1基因的miVP1 對YEZ 株的抑制作用相當(dāng)，但前者對LYG株的抑制效率明顯低于后者，可能原因是作為主要結(jié)構(gòu)和抗原蛋白，VP2 容易受免疫選擇壓力等因素的影響而容易發(fā)生突變，特別是其高變區(qū)［18］，而作為RNA 依賴的RNA 聚合酶的VP1，在不同毒株間相對保守［19］。這些研究結(jié)果提示，VP1 更適合作為RNA 干擾IBDV 復(fù)制的靶基因。

總之，作為有效表達(dá)干擾RNA 的載體，rAAAV除具有無致病性和穩(wěn)定表達(dá)等優(yōu)點外，表達(dá)針對不同IBDV 毒株共有保守區(qū)siRNA 或miRNA 的rAAAV 有可能克服疫苗免疫的弊端，有望成為預(yù)防IBD 的新型生物制劑。

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