李 威，邱細(xì)敏，郭思維，王 瓊

(湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410006)

結(jié)核是一種世界性的傳染性疾病，每年引起數(shù)萬人死亡，其中死亡人數(shù)最多的主要是在發(fā)展中國家，尤其是在亞洲［1］。近年來，盡管全球結(jié)核發(fā)病率正在下降，但耐藥性也正在迅速發(fā)展和蔓延［2］。利福平(Rifampicin，RFP)是經(jīng)典有效的一線藥物，但RFP 因誘導(dǎo)肝臟微粒體氧化酶［3-4］、個體差異大、生物利用度變化大［2，5-6］等缺點(diǎn)，使其在血液中的濃度或高或低，導(dǎo)致一系列的不良后果，如耐藥菌的產(chǎn)生、治療的失敗、治療療程的延長、嚴(yán)重的肝損害以及對其它藥物產(chǎn)生影響［7-8］。因此，通過測定RFP血藥濃度來調(diào)整給藥劑量以維持RFP 的有效血藥濃度已經(jīng)變得非常重要。

目前有一些高效液相色譜法［3，9-11］用于人血漿中RFP 的測定，但這些方法樣品處理復(fù)雜、成本高、干擾多，不適于用于RFP 長期的血藥濃度監(jiān)測。與以往方法比較，本文采用2D-HPLC-LVI 法測定人血漿中的RFP，具有樣品處理簡單、無需內(nèi)標(biāo)、結(jié)果準(zhǔn)確度高和自動化程度高等優(yōu)點(diǎn)，適于臨床RFP 血藥濃度監(jiān)測。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

2D-HPLC-LVI (large volμme injection，LVI)系統(tǒng)主要由萃取系統(tǒng)和分析系統(tǒng)兩部分組成。萃取系統(tǒng)主要負(fù)責(zé)樣品富集和初級去除雜質(zhì);分析系統(tǒng)主要負(fù)責(zé)樣品的分離監(jiān)測;中間接口采用“中心切割”的柱柱轉(zhuǎn)換模式。整個系統(tǒng)主要由日本島津高效液相色譜儀組成，包括2 個LC-10AT 單元泵(Pump1和Pump2)、LC-10ATvp 四元低壓色譜泵(Pump3)、SIL-10ADvp 自進(jìn)樣器、SPD-10Avp 檢測器、500 μL定量環(huán)和1 個六通閥;另外離心機(jī)為HS145 型(長沙安萊科分析儀器有限公司)，電子天平(AND GH-202，十萬分之一，日本)。

1.2 試劑

RFP(含量＞99. 0%，批號:130496200501)。維生素C(含量＞99.7%)。特丁基對苯二酚(TBHQ，含量＞99.0%)。色譜純:甲醇、乙腈;分析純:磷酸二氫銨，磷酸;自制蒸餾水，空白血漿(中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院血液科)，所有試劑經(jīng)過檢測，無干擾。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品儲備液和質(zhì)控品的配制

精密稱取RFP 對照品200.0 mg，置于25 mL 棕色容量瓶中，加適量含0.5 mol/LTBHQ 的乙腈超聲溶解，并用含0.5 mol/L TBHQ 的乙腈定容，混勻，置于-20℃的冰箱保存，即得濃度為8.0 mg/mL 的RFP 儲備液。使用時用甲醇溶液稀釋成所需濃度的工作液。

取相同體積的空白血漿加入相同體積不同濃度的工作液，配制成低(0.4 μg/mL)、中(6.0 μg/mL)和高(16.0 μg/mL)3 個濃度的質(zhì)控品。所有質(zhì)控品置于-70℃保存。

2.2 血樣的處理

精密吸取0.3 mL 血漿于含30 μL2.8 mol/mL維生素C 和0.6 mL 乙腈的EP 管，渦旋震蕩1. 0 min，再在14500 r/min 離心8 min，取上清液100 μL進(jìn)樣。

2.3 色譜條件

輔助液是2.0 mmol/L 磷酸溶液(pH =3.00)。萃取流動相:84 mmol/mL 磷酸二氫銨溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH 值為3.32)-乙腈-甲醇=55∶24∶21。分析流動相:42 mmol/mL 磷酸二氫銨溶液(pH =4.60)-乙腈-甲醇=48∶38∶14。樣品經(jīng)乙腈蛋白沉淀處理后，100 μL 上清液在PΜMP1 和PΜMP2 條件下進(jìn)入萃取柱，并在PΜMP2 下，實現(xiàn)在線樣品萃取除雜;接著在PΜMP2 條件下，采用“中心切割”模式將目標(biāo)物轉(zhuǎn)移到自制C18陷阱柱;最后用六通閥連接陷阱柱和分析柱，完成目標(biāo)物的分離檢測。柱溫40℃，檢測波長333 nm，進(jìn)樣量100 μL。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 色譜行為和方法專屬性 RFP 保留時間tR為9.80 min，色譜峰寬為0.55 min，通過萃取柱及分析柱的兩級分離后色譜峰在tR±2.5 min 內(nèi)無其他干擾峰(圖1)。另外，目標(biāo)物在萃取柱和分析柱之間轉(zhuǎn)移時造成5.5 min ～6.5 min 之間的溶劑峰。

2.4.2 線性關(guān)系考察 精密吸取RFP 標(biāo)準(zhǔn)工作液，加空白血漿配制成濃度為0.2、0.6、2. 0、8.00、14.0、20. 00 μg/mL 的RFP 標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品，再按“2.2”項下步驟操作處理。結(jié)果RFP 在0. 20 ～20.00 μg/mL 呈良好的線性關(guān)系，以濃度為自變量(X)，峰面積為因變量(Y)，其回歸方程為y =114716.4x-2533.8，R2=0.9999。

2.4.3 最低定量限考察 最低定量限(LLOQ)以RFP 色譜峰完全達(dá)到基線分離，峰面積RSD ≤20%，準(zhǔn)確度在80% ～120%來計算。結(jié)果血漿中RFP 的最低定量限分別為0.12 μg、mL，完全滿足臨床RFP 的治療藥物檢測要求。

2.4.4 絕對回收率考察 取低、中、高3 個濃度的RFP 質(zhì)控品(n =6)，按“2.2”項下操作處理。所得峰面積與對應(yīng)相同濃度的同樣處理的RFP 對照品溶液所的峰面積進(jìn)行比較，其結(jié)果如表2。

2.4.5 準(zhǔn)確度和精密度考察 取低、中、高3 個濃度的RFP 質(zhì)控品，按“2.2”項下操作處理。日內(nèi)精密度數(shù)據(jù)通過日內(nèi)測定RFP 標(biāo)準(zhǔn)血樣低、中、高3個濃度得到(n=6)，日間精密度數(shù)據(jù)通過連續(xù)測定3 d 高、中、低3 個濃度，每日每個濃度6 份得到，其結(jié)果如表1。

圖1 A. 空白血漿;B. 對照品+空白血漿(14.0μg/mL);

表1 方法的回收率、精密度和準(zhǔn)確度

2.4.6 穩(wěn)定性考察 取低、中、高3 個濃度的RIF質(zhì)控樣品和經(jīng)處理的質(zhì)控品，分別于室溫放置0h、2h 和4h，4℃放置0h、12h 和24h，-20℃放置0d、7d和14d 后，按“2.2”項下操作處理(除經(jīng)處理的質(zhì)控品外)。另外，于-20℃冷凍保存24 h 后室溫下解凍測定，連續(xù)3 次。結(jié)果表明血漿中的RIF 在實驗條件下穩(wěn)定性良好，符合治療藥物監(jiān)測的要求。

2.5 臨床樣品的測定

本方法已成功用于RFP 口服劑量為0.45g 的15 例病人的血藥濃度監(jiān)測。在給藥2 h 后進(jìn)行樣品采集，并且在2 h 內(nèi)完成分析檢測或者在被分析之前保存在-70℃。測定的濃度結(jié)果范圍在1.25 ～13.8 μg/mL。

3 討論

3.1 適合于日常治療藥物監(jiān)測

近年來，許多文獻(xiàn)報道了測定血漿中各種藥物濃度的柱切換HPLC 法［12-14］。相比這些方法，本方法具有2 大特點(diǎn):①具有聚焦體系，通過在特定時間內(nèi)改變流動相來使分析物以“塞狀”進(jìn)入色譜柱，從而減小由大體積進(jìn)樣的峰擴(kuò)散引起的誤差。②引入了1 根陷阱柱，使該系統(tǒng)具備2 次除雜的能力。另外，該方法的自動化程度高，樣品只需經(jīng)乙腈蛋白沉淀處理。統(tǒng)計不同檢測人員的測試結(jié)果發(fā)現(xiàn):不同檢測人員操作引入的誤差被控制在5%以內(nèi)。因此，無需內(nèi)標(biāo)校正，該系統(tǒng)也能獲得很好的精密度、準(zhǔn)確度和重復(fù)性。

3.2 大體積進(jìn)樣

為了滿足臨床上RFP 的檢測要求，本方法通過采用LVI 來提高方法的靈敏度。實驗考察了進(jìn)樣體積為100 μL、200 μL 和500 μL 時的方法最低定量限，結(jié)果見圖2。當(dāng)進(jìn)樣體積為500 μL 時，方法的最低定量限為0.03 μg/mL。但實驗發(fā)現(xiàn):隨著進(jìn)樣體積的增加，萃取柱的壽命縮短，因此，在滿足測定要求的前提下，盡可能選擇小體積的進(jìn)樣量。當(dāng)進(jìn)樣量為100μL 時，方法的最低定量限是0. 12μg/mL。

圖2 進(jìn)樣體積為100μL、200μL 和500μL 最低定量限的色譜圖

3.3 色譜條件的優(yōu)化

鑒于RFP 分子結(jié)構(gòu)式的特點(diǎn)，實驗考察了Venusil SCX 和XtimateC18兩種色譜柱。經(jīng)過測試，選擇柱效較好的XtimateC18柱作為分析柱，同時將Venusil SCX 柱作為萃取柱，使兩者構(gòu)成具有強(qiáng)抗干擾能力的二維色譜體系。對于陷阱柱，實驗同樣測試了自制SCX 柱和自制C18柱，結(jié)果:相對于自制SCX柱，自制C18柱更強(qiáng)的除雜能力。因此，本文將Venusil SCX 柱(50 mm×4.6 mm，5 μm)，自制C18柱(10 mm ×4.6 mm，5 μm)和Xtimate C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)分別作為系統(tǒng)的萃取柱、陷阱柱和分析柱。為了盡量縮短保留時間和使峰變得尖銳，聚焦液、萃取流動相和分析流動相的流速分別是2.0 mL/min、1.0 mL/min 和1.2 mL/min。

3.4 血樣的處理

實驗早期，樣品用純乙腈進(jìn)行沉淀，但發(fā)現(xiàn)RFP峰面積隨著放置的時間越長變的越小，同時其后出現(xiàn)一個未知的、隨時間越來越大的色譜峰。有文獻(xiàn)報道［2］RFP 血樣在-20℃或室溫容易被氧化。因此本文在RFP 血樣和標(biāo)準(zhǔn)溶液中分別加入了一定量的抗氧化劑維生素C 和特丁基對苯二酚(易溶于有機(jī)溶劑)，以確保其檢測期間的穩(wěn)定性。

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