楊 揚，段華新

(湖南師范大學第一附屬醫(yī)院，湖南省人民醫(yī)院，湖南 長沙 410005)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，乳腺癌的病因尚未完全闡明，診斷其浸潤、轉(zhuǎn)移及預后的指標尚需進一步研究。它的侵襲、轉(zhuǎn)移是一個多因素參與、多步驟完成的復雜過程，而基質(zhì)金屬蛋白酶家族(matrix metallop roteinases，MMPS)對細胞外基質(zhì)和基底膜的降解是腫瘤細胞侵襲、轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵，其中基質(zhì)金屬蛋白酶-9 (MMP-9 )是最重要的酶類。在腫瘤生長、浸潤和轉(zhuǎn)移過程中起著關(guān)鍵性的作用。本文從蛋白水平及mRNA 水平研究MMP-9 在乳腺癌中的表達及意義。

1 材料與方法

1.1 標本來源

選取湖南省人民醫(yī)院2012 ～2014年診治的乳腺癌患者45 例，均為女性作為一組。病理活檢均為浸潤性導管癌，其中28 例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，17 例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，均行乳腺癌根治術(shù)或改良根治術(shù)，術(shù)前均未經(jīng)任何治療;乳腺良性病變20 例作為對照組，病理活檢為乳腺纖維腺瘤14 例，纖維囊性乳腺病6 例。標本分兩份，一份經(jīng)10% 中性福爾馬林固定，石蠟包埋，連續(xù)4 μm 切片，供常規(guī)HE 染色和免疫組化染色;一份迅速投入液氮中速凍，然后置于－70℃的冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 免疫組化染色檢測

應(yīng)用免疫組化方法檢測乳腺癌組及對照組組織中MMP-9 的表達(兔抗人MMP-9 單克隆抗體、免疫組化試劑盒均購自北京中杉金橋公司)，MMP-9 單克隆抗體工作濃度為1∶100，AEC 顯色，用PBS 緩沖液代替一抗作為空白對照，用已知MMP-9 陽性乳腺癌切片作陽性對照(北京中杉金橋公司提供)。腫瘤細胞胞漿中出現(xiàn)紅色顆粒即為陽性細胞。對免疫組化染色結(jié)果進行半定量分析，按照細胞著色的程度分成:陽性細胞數(shù)＜10% 為(－)，陽性細胞數(shù)10% ～25%為(+)，25% ～50% (++)，＞50%為(+++)。

1.3 RT-PCR 檢測

1.3.1 引物設(shè)計

MMP-9 引物設(shè)計參照文獻［1］合成，上游引物序列:5'-GAGGAATACCTGTACCGCTATG-3'，下游引物序列:5'-CAAACCGAGTTGGAACCAC-3';β 肌動蛋白(β-actin)上游引物序列:5'-AAGGACTGCTACGTCGG-3'，下游引物序列:5'-CCTGCCATGTATGTCGCT-3'。PCR 擴增片段分別為531 bp 和258 bp，由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。

1.3. 2 總RNA 提取

用Trizol(Invitrogen 公司)提取乳腺癌組及對照組組織中的總RNA 后，用紫外分光光度計測總RNA 的A260/A280，比值在1.8 ～2.0 之間，說明純度良好;取2 μL RNA 在1.5%瓊脂糖凝膠電泳以檢測RNA 的完整性。

1.3.3 DNA 的合成

20μL 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中包括樣品總RNA 2 ～4 μg，Oligo(dT)18 1μL，10 mmol/L dNTP mix 2μL，M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶1μL(MBI)，RNA 抑制酶1μL，5×反應(yīng)緩沖液4μL 和DEPC 處理水9 ～10μL，反應(yīng)條件為42℃1 h，然后70℃滅活10 min。

1.3.4 PCR 擴增

以cDNA 為模板，擴增目的基因片斷，β-actin作為內(nèi)參照物。PCR 反應(yīng)MMP-9 和β-actin 引物在同一EP 管中進行。其中cDNA2.5μL，TaqDNA 聚合酶0. 5μL，上游引物0. 4μL，下游引物0. 4μL，dNTP0.5μL，MgCl22.0μL，10 ×反應(yīng)緩沖液2.5μL，加去離子水構(gòu)建為總體積25μL 的反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)條件:95℃預變性3 min，94℃40s，58℃40 s，72℃40 s，35 個循環(huán)，72℃延伸5 min。PCR 擴增后取5μL 擴增產(chǎn)物，進行1.2% 瓊脂糖凝膠電泳對擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳分析。紫外燈下觀察結(jié)果、拍照，在電腦凝膠成像系統(tǒng)中分析電泳帶的灰度，用MMP-9/β-actin 的比值表示MMP-9 的相對表達水平。

1.4 統(tǒng)計學處理

應(yīng)用SPSS13.0 統(tǒng)計軟件對所獲得的數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以mean±SD 表示，各表達指標的組間差異在進行方差齊性檢驗后，采用t 檢驗或近似t 檢驗，計數(shù)資料的比較采用卡方檢驗，P ＜0.05 差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2. 1 MMP-9 在乳腺不同病變組織中的表達

MMP-9 在乳腺癌細胞的胞膜和(或)胞質(zhì)呈陽性表達，在腫瘤細胞膜上出現(xiàn)彌漫且較強的紅色(圖1)。由表1 可見，乳腺癌組中的陽性表達率為80%，對照組MMP-9 陽性表達率為20%。乳腺癌組MMP-9 的表達率顯著高于對照組(P ＜0.05)。

表1 MMP-9 在乳腺不同病變組織中的表達

圖1 A.MMP-9 在乳腺纖維腺瘤中陰性表達(×400);B. MMP-9 在乳腺癌中陽性表達(×400)

2.2 乳腺癌組織和對照組織中MMP-9mRNA 和β-actin 擴增電泳結(jié)果

表2、圖2 結(jié)果顯示，MMP-9mRNA 在二組均有表達，乳腺癌組平均表達水平為0.9142 ±0.1081高于對照組表達平均水平為0. 3794 ±0.0428，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0. 01 )。

表2 二組織中MMP-9mRNA 水平比較

圖2 乳腺癌組織和對照組織中MMP-9mRNA和β-actin 擴增電泳結(jié)果

3 討論

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是指一系列生理情況下可降解細胞外基質(zhì)(ECM)及基底膜的內(nèi)肽酶總稱，通常由纖維母細胞、中性白細胞、巨噬細胞及腫瘤細胞產(chǎn)生。MMPs 是一族鋅離子依賴性蛋白水解酶，目前發(fā)現(xiàn)有23 種，它們是參與細胞外基質(zhì)代謝的主要酶類，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，MMP 常過度表達，在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的過程中，此類蛋白酶(尤其以MMP-2，MMP-9)起了非常重要的作用。MMPs可降解ECM 而形成腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的通道［2］。MMPs不但可以降解基底膜和腫瘤組織周邊的細胞外基質(zhì)，并且能夠促進血管的生成，這些作用為腫瘤的生長、局部侵襲乃至遠處轉(zhuǎn)移創(chuàng)造了有利的條件，因此MMPs 的存在被認為對于惡性腫瘤而言具有重大的意義。

基質(zhì)金屬蛋白酶-9 (MMP-9 )是MMPs 家族中最重要的酶類，在腫瘤的發(fā)生轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用。如Scott 等［3］通過RT-PCR 檢測到MMP-9 mRNA 在皮膚角質(zhì)細胞腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中表達升高且參與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移，而Sajani 等［4］通過RNA 干擾技術(shù)抑制MMP-9 基因的表達則能抑制腫瘤生長，減少腫瘤的轉(zhuǎn)移。王祥軍［5］等采用免疫組織化學法，檢測50 例乳腺癌及20 例癌旁正常組織中MMP-9 蛋白的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中MMP-9 的陽性表達率為66% (33 /50)，顯著高于癌旁組織。

本研究采用免疫組織化學和RT-PCR 進行檢測，一方面在大多數(shù)惡性腫瘤中MMP-9 除來自腫瘤細胞本身以外主要來自間質(zhì)細胞，尤其是成纖維細胞，兩種不同的細胞同時表達MMP-9，這為免疫組化檢測MMP-9 的表達的結(jié)果評價帶來一定的困難;另一方面，在很多情況下，蛋白質(zhì)的變化與基因表達并不一致，故在本研究中還采用RT-PCR 檢測整個腫瘤組織包括間質(zhì)成分中MMP-9 mRNA 的相對表達量，更能如實地反映MMP-9 的表達水平，更易于評價。本研究免疫組化結(jié)果顯示，在乳腺癌組織中MMP-9 蛋白的表達顯著高于乳腺纖維瘤組織，RTPCR 的結(jié)果也表明MMP-9 mRNA 在乳腺癌中的表達顯著高于對照組。本實驗應(yīng)用靈敏度高很高的RT-PCR 檢測乳腺癌患者組織切片中MMP-9 mRNA的表達，較之免疫組化技術(shù)大大提高了檢出率?？傊?，MMP-9 表達的測定可作為乳腺癌浸潤轉(zhuǎn)移的重要分子學標志物，選擇針對MMP-9 作為靶點的靶向治療，來降低乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移可能為乳腺癌綜合治療提供一種新的途徑。

［1］Yang JM，Xu Z，Wu H，et al. Over expression of extracellular matrix metalloproteinase inducer in multidrug resistant cancer cells［J］.Molecular Cancer Res，2003，1(6):420-427.

［2］Bisson C，Blacher S，Polette M，et al. Restricted expression of membrane type 1-matrix metalloproteinase by myofibroblasts adjacent to human breast cancer cells［J］. Int J Cancer，2003，105 (1):7-13.

［3］Scott KA，Arnott CH，Robinson SC，et al. TNF-alpha regulates epithelial expression of MMP-9 and integrin alphavbeta6 during tumour promotion. A role for TNF-alpha in keratinocyte migration［J］. Oncogene，2004，23(41):6954-6966.

［4］Lakka SS，Gondi CS，Yanamandra N，et al. Inhibition of cathepsin B and MMP-9 gene expression in glioblastoma cell line via RNA interference reduces tumor cell invasion，tumor growth and angiogenesis［J］. Oncogene，2004，23(27):4681-4689.

［5］王祥軍，周士福，時偉峰，等.CD147 和MMP-9 在乳腺浸潤性導管癌中的表達及其相關(guān)性［J］.實用癌癥雜志，2009，24(2):141-143.