劉 婷 歐陽(yáng)夢(mèng)云 王 燕 吳 佳 李 凱 劉賓翰

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410128;2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)東方科技學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410128)

白藜蘆醇是一種非黃酮類(lèi)多酚化合物，具有酚和芪的特性，無(wú)味，白色針狀晶體，難溶于水，易溶于甲醇、乙醇、三氯甲烷、丙酮等有機(jī)溶劑。天然白藜蘆醇有順、反兩種結(jié)構(gòu)，自然界中主要以反式構(gòu)象(生理活性強(qiáng)于順式異構(gòu)體)存在，且兩種結(jié)構(gòu)都可與葡萄糖結(jié)合，分別形成順式和反式白藜蘆醇糖苷［1］。研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇具有抗炎、抗過(guò)敏、抗病原微生物［2］、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［3］、提高免疫功能［4］、降低血脂、抗血小板聚集［5］等多種生理活性，已被喻為繼紫杉醇后又一新的綠色抗癌藥物。白藜蘆醇主要存在于葡萄、虎杖、花生、桑椹、松樹(shù)等21個(gè)科、31個(gè)屬的72種植物中，在湖南、貴州等地的刺葡萄中含量較高［6］。

刺葡萄(V.didii.Foex)是中國(guó)南方主要野生葡萄品種之一，湖南湘西一帶擁有廣泛的刺葡萄野生資源。刺葡萄具有粒小、皮厚、色深和產(chǎn)量高等特點(diǎn)，作為食用鮮果其市場(chǎng)受到一定限制［7］，但適宜用于葡萄酒的釀造［8］。由于中國(guó)葡萄酒生產(chǎn)季節(jié)性強(qiáng)、生產(chǎn)集中，釀酒后的酒渣往往來(lái)不及處理就被隨意拋棄或作為廢料處理，造成了極大的環(huán)境污染和資源浪費(fèi)，因此，從刺葡萄酒渣中提取有價(jià)值的活性物質(zhì)，變廢為寶，具有重要的經(jīng)濟(jì)與環(huán)保效益。目前從刺葡萄酒渣中提取白藜蘆醇未見(jiàn)報(bào)道，本研究擬采用超聲輔助法從刺葡萄酒渣中提取白藜蘆醇，并對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期為刺葡萄的綜合開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

刺葡萄酒渣:紫秋刺葡萄，湖南華淳莊園酒業(yè)有限公司;

反式白藜蘆醇苷標(biāo)準(zhǔn)品:純度＞98.6%，成都曼思特生物科技有限公司;無(wú)水乙醇:分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;甲醇、乙腈:色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀:Agilent 1100 Series型，安捷倫科技有限公司;

電子分析天平:CP214型，奧豪斯儀器(上海)有限公司;

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱:DHG-9240A型，上海飛越實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;

中草藥粉碎機(jī):FW177型，天津市泰斯特儀器有限公司;

數(shù)控超聲波清洗器:KQ-250DE型，昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 原材料預(yù)處理 經(jīng)電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱50℃烘干，粉碎，過(guò)40目篩，4℃下避光儲(chǔ)藏，備用。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

(1)溶劑(乙醇)濃度對(duì)白藜蘆醇提取率的影響:準(zhǔn)確稱(chēng)取5份1.000 g刺葡萄酒渣粉末，分別放于不同的100 mL棕色容量瓶中，在料液比1∶15(m∶V)，超聲時(shí)間40 min，超聲溫度55℃的條件下，分別用20%，40%，60%，80%，99.7%的乙醇對(duì)刺葡萄酒渣中的白藜蘆醇進(jìn)行提取，快速濾紙過(guò)濾，再經(jīng)0.22 μm有機(jī)微孔濾膜后，用高效液相色譜測(cè)定白藜蘆醇含量。

(2)料液比對(duì)白藜蘆醇提取率的影響:準(zhǔn)確稱(chēng)取5份1.000 g刺葡萄酒渣粉末，分別放于不同的100 mL棕色容量瓶中，按料液比1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30(m∶V)分別加入一定體積80%的乙醇，在55℃下超聲提取40 min，快速濾紙過(guò)濾，再經(jīng)0.22 μm有機(jī)微孔濾膜后，用高效液相色譜測(cè)定白藜蘆醇含量。

(3)超聲時(shí)間對(duì)白藜蘆醇提取率的影響:準(zhǔn)確稱(chēng)取6份1.000 g刺葡萄酒渣粉末，分別放于不同的100 mL棕色容量瓶中，用80%的乙醇在料液比1∶15(m∶V)，55℃條件下，分別超聲提取 10，20，30，40，50，60 min，快速濾紙過(guò)濾，再經(jīng)0.22 μm有機(jī)微孔濾膜后，用高效液相色譜測(cè)定白藜蘆醇含量。

(4)超聲溫度對(duì)白藜蘆醇提取率的影響:準(zhǔn)確稱(chēng)取5份1.000 g刺葡萄酒渣粉末，分別放于不同的100 mL棕色容量瓶中，按料液比1∶15(m∶V)加入80%的乙醇，分別在25，40，55，70，85 ℃下超聲提取40 min，快速濾紙過(guò)濾，再經(jīng)0.22 μm有機(jī)微孔濾膜后，用高效液相色譜測(cè)定白藜蘆醇含量。

1.3.3 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken原理，以白藜蘆醇提取率為響應(yīng)值，對(duì)料液比、超聲溫度、超聲時(shí)間進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，運(yùn)用Design-Expert 8.0.5.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析優(yōu)化，得出刺葡萄酒渣中白藜蘆醇的最佳提取工藝。

1.3.4 白藜蘆醇提取率的測(cè)定

(1)色譜條件:參照GB/T 15038—2006，最終確定高效液相色譜測(cè)定條件為色譜柱:Agilent，ODS C18 hypersil(250 mm ×4.5 mm，5 μm);流動(dòng)相:乙腈 +重蒸水 =30%+70%;柱溫:21℃;流速:1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):306 nm;進(jìn)樣量:10 μL。

(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作:精確稱(chēng)取2.000 mg反式白藜蘆醇苷標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，得濃度為200 μg/mL的反式白藜蘆醇苷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別準(zhǔn)確吸取0.25，0.5，1，2，4 mL 于5 個(gè)不同的10 mL 棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻得 5，10，20，40，80 μg/mL 的反式白藜蘆醇苷系列標(biāo)準(zhǔn)液。取10 μL在1.3.4(1)條件下進(jìn)樣，以吸收峰面積值(Y)為縱坐標(biāo)，反式白藜蘆醇苷濃度(X)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程:

式中:

Y——白藜蘆醇苷吸收峰面積;

X——白藜蘆醇苷濃度，μg/mL。

(3)樣品測(cè)定:吸取待測(cè)液 10 μL，在 1.3.4(1)條件下測(cè)定，重復(fù)2次。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得出待測(cè)液中白藜蘆醇苷的濃度，按式(2)計(jì)算提取率:

式中:

R——白藜蘆醇苷的提取率，μg/g;

C——待測(cè)液中白藜蘆醇苷的濃度，μg/mL;

V——提取溶劑的體積，mL;

M——樣品的質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 乙醇濃度對(duì)白藜蘆醇提取率的影響 由圖1可知，隨著乙醇濃度的增加，白藜蘆醇的提取率逐漸提高，當(dāng)提取劑乙醇濃度為80%時(shí)，提取率達(dá)到最大值，繼續(xù)增加乙醇濃度，白藜蘆醇提取率反而略有下降。這可能是因?yàn)榘邹继J醇含有多個(gè)酚羥基，具有較大的極性，根據(jù)相似相溶原理，當(dāng)溶劑極性與白藜蘆醇極性相當(dāng)時(shí)，白藜蘆醇溶解性大，提取率高。但乙醇濃度過(guò)高時(shí)，大量脂溶性色素溶出，與白藜蘆醇競(jìng)爭(zhēng)溶劑分子，從而導(dǎo)致白藜蘆醇提取率略有下降。故選取80%乙醇為提取劑。

圖1 乙醇濃度對(duì)白藜蘆醇提取率的影響Figure 1 Effects of ethanol concentration on the extraction of resveratrol

2.1.2 料液比對(duì)白藜蘆醇提取率的影響 由圖2可知，在料液比為1∶10～1∶20(m∶V)時(shí)，白藜蘆醇的提取率隨著溶劑體積的增加而增大，但當(dāng)料液比小于1∶20(m∶V)后，隨著溶劑體積的增大，白藜蘆醇的提取率反而降低。這是由于在提取過(guò)程中，刺葡萄酒渣粉末的質(zhì)量固定，當(dāng)溶劑體積較小時(shí)，隨著溶劑的增加，有效成分與溶劑的接觸面積增大，從而使白藜蘆醇的提取率升高;但當(dāng)溶劑體積過(guò)大時(shí)，超聲波輻射被溶劑大量吸收，穿透能力下降，作用于物料的有效輻射降低，從而影響有效成分的提?。?］，同時(shí)溶劑體積過(guò)大會(huì)造成溶劑浪費(fèi)。故選取最佳料液比為1∶20(m∶V)。

2.1.3 超聲時(shí)間對(duì)白藜蘆醇提取率的影響 由圖3可知，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，白藜蘆醇的提取率上升，且在40 min內(nèi)，增幅明顯。但提取時(shí)間超過(guò)40 min后，白藜蘆醇的提取率趨于平穩(wěn)，甚至略有下降，這可能是由于超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，空化效應(yīng)的作用力降低，也有可能是長(zhǎng)時(shí)間的超聲破壞了白藜蘆醇的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致白藜蘆醇部分降解。故選取最佳提取時(shí)間為40 min。

圖2 料液比對(duì)白藜蘆醇提取率的影響Figure 2 Effects of solid/solvent ratio on the extraction of resveratrol

圖3 超聲時(shí)間對(duì)白藜蘆醇提取率的影響Figure 3 Effects of ultrasonic time on the extraction of resveratrol

2.1.4 超聲溫度對(duì)白藜蘆醇提取率的影響 由圖4可知，隨著超聲溫度的升高，白藜蘆醇的提取率逐漸提高，這是因?yàn)槌暅囟壬吣苁怪参锝M織軟化，提高有效成分的擴(kuò)散速度;當(dāng)溫度為55℃左右時(shí)，提取率達(dá)到最大值，繼續(xù)提高超聲溫度，白藜蘆醇的提取率略有下降。且高溫會(huì)破壞白藜蘆醇的生理活性，故選取最佳超聲溫度為55℃。

圖4 超聲溫度對(duì)白藜蘆醇提取率的影響Figure 4 Effects of ultrasonic temperature on the extraction of resveratrol

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面分析試驗(yàn)結(jié)果 綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取料液比、超聲溫度、超聲時(shí)間為響應(yīng)面優(yōu)化的三因素，對(duì)白藜蘆醇的提取率進(jìn)行分析，具體試驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表1、2。

表1 響應(yīng)面分析試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of RSM test

表2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

運(yùn)用Design-Expert 8.0.5.0軟件對(duì)表2中試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，得刺葡萄酒渣中白藜蘆醇的提取率與所選3個(gè)因素的二元多次回歸方程為:

對(duì)表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，模型的F=86.81，P＜0.000 1，表示模型顯著，且模型的失擬項(xiàng)P=0.175 8＞0.05，不顯著，表明模型擬合度較好，殘差均由隨機(jī)誤差引起。模型的決定系數(shù)R2=0.991 1，表明響應(yīng)值白藜蘆醇提取率實(shí)際值與預(yù)測(cè)值之間具有良好的擬合度，調(diào)整系數(shù)Radj2=0.979 7，說(shuō)明該模型能用于解釋97.97%響應(yīng)值的變化，預(yù)測(cè)系數(shù)Rpred2=0.899 7，說(shuō)明該模型預(yù)測(cè)性良好［10，11］，所以，該模型可用于刺葡萄酒渣中白藜蘆醇提取條件的分析和預(yù)測(cè)。且各因素的一次項(xiàng)和二次項(xiàng)的影響均為極顯著(P≤0.01)，說(shuō)明各因素對(duì)刺葡萄酒渣中白藜蘆醇提取率的影響并非簡(jiǎn)單的線(xiàn)性關(guān)系［12］。根據(jù)各因素F值的大小可得，影響白藜蘆醇提取率的因素主次順序?yàn)?超聲時(shí)間＞超聲溫度＞料液比。

表3 響應(yīng)面結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of response surface results

表3 響應(yīng)面結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of response surface results

＊＊表示影響極顯著，P≤0.01;*表示影響顯著，P≤0.05;N表示影響不顯著，P＞0.05。

方差來(lái)源 平方和 自由度 均方 F值 P 值 顯著性模型 3 448.84 9 383.20 86.81 ＜0.000 1＊＊A 319.79 1 319.79 72.45 ＜0.000 1 ＊＊ 3 479.74 16 B 30.90 7 4.41失擬項(xiàng) 20.83 3 6.94 2.76 0.175 8 N純誤差 10.07 4 2.52總和565.82 1 565.82 128.19 ＜0.000 1 ＊＊C 1 159.21 1 1 159.21 262.61 ＜0.000 1 ＊＊AB 0.71 1 0.17 0.038 0.850 8 N AC 27.04 1 27.04 6.13 0.042 5 *BC 5.71 1 5.71 1.29 0.292 7 N A2 444.01 1 444.01 100.59 ＜0.000 1 ＊＊B2 525.72 1 525.72 119.10 ＜0.000 1 ＊＊C2 260.72 1 260.72 59.07 0.000 1 ＊＊?dú)埐?/p>

2.2.2 響應(yīng)面交互作用分析 根據(jù)回歸方程，將其中任一因素固定在0水平?？梢缘玫襟w現(xiàn)另外兩因素及其交互作用的響應(yīng)曲面圖［13］(見(jiàn)圖5～7)。由圖5～7可知，沿時(shí)間軸向等高線(xiàn)變化最密集，且時(shí)間曲線(xiàn)最陡峭，說(shuō)明超聲時(shí)間對(duì)響應(yīng)值的影響最顯著［14］，這與表3中根據(jù)各因素的F值大小得出的結(jié)論符合;分析等高線(xiàn)，結(jié)合表3中各因素的P值可知，超聲時(shí)間和料液比的交互作用顯著。

圖5為超聲時(shí)間為40 min時(shí)，溫度和料液比及其交互作用對(duì)白藜蘆醇提取率影響的曲面圖。由圖5可知，當(dāng)料液比一定時(shí)，隨著溫度的升高，白藜蘆醇的提取率呈先增高后降低的趨勢(shì);當(dāng)溫度一定時(shí)，白藜蘆醇的提取率隨著溶劑體積的增大而先增大后平緩。

圖5 超聲溫度和料液比對(duì)白藜蘆醇提取率影響的響應(yīng)面Figure 5 Responsive surface and contours of the effect of temperature and solid/solvent ratio on the extraction rate of resveratrol

圖6為超聲溫度為55℃時(shí)，超聲時(shí)間和料液比及其交互作用對(duì)白藜蘆醇提取率影響的曲面圖。由圖6可知，當(dāng)料液比一定時(shí)，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，白藜蘆醇的提取率增大;當(dāng)超聲時(shí)間一定時(shí)，隨著溶劑體積的增大，白藜蘆醇提取率先增大再減少，且增大的幅度并不大。

圖7為料液比為1∶15(m∶V)時(shí)，超聲時(shí)間和溫度及其交互作用對(duì)白藜蘆醇提取率影響的曲面圖。由圖7可知，當(dāng)超聲時(shí)間一定時(shí)，隨著溫度的升高，白藜蘆醇的提取先增大后略有減少;當(dāng)超聲溫度一定時(shí)，白藜蘆醇的提取率隨超聲時(shí)間的增加而增加。

2.2.3 白藜蘆醇最優(yōu)工藝條件的確定與驗(yàn)證 在各因素選定范圍內(nèi)，利用軟件Design-Expert 8.0.5.0對(duì)模型進(jìn)行分析優(yōu)化，預(yù)測(cè)出最優(yōu)提取條件為超聲溫度61.37℃，超聲時(shí)間48.67 min，料液比 1∶17.11(m∶V)，且在該條件下白藜蘆醇提取率的預(yù)測(cè)值為191.63 μg/g?？紤]到實(shí)際操作的方便，將提取工藝參數(shù)調(diào)整為:超聲溫度61℃，超聲時(shí)間49 min，料液比1∶17(m∶V)，并在該條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，白藜蘆醇(以反式白藜蘆醇苷的形式存在)的平均提取率為 191.53 μg/g，與理論預(yù)測(cè)值 191.63 μg/g 接近，表明響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)得到的提取工藝參數(shù)可靠。

圖6 超聲時(shí)間和料液比對(duì)白藜蘆醇提取率影響的響應(yīng)面Figure 6 Responsive surface and contours of the effect of time and solid/solvent ratio on the extraction rate of resveratrol

圖7 超聲時(shí)間和溫度對(duì)白藜蘆醇提取率影響的響應(yīng)面Figure 7 Responsive surface and contours of the effect of time and temperature on the extraction rate of resveratrol

3 結(jié)論

本研究在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法對(duì)刺葡萄酒渣中白藜蘆醇的超聲輔助提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并建立了白藜蘆醇提取率與超聲溫度、超聲時(shí)間、料液比3個(gè)因素的二次多項(xiàng)式回歸模型，通過(guò)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)證明該模型是科學(xué)可靠的。

本研究經(jīng)優(yōu)化得出超聲輔助提取刺葡萄酒渣中白藜蘆醇的最優(yōu)工藝為:超聲溫度61℃，超聲時(shí)間49 min，料液比1∶17(m∶V)，此條件下白藜蘆醇(以反式白藜蘆醇苷的形式存在)的提取率為191.53 μg/g，與預(yù)測(cè)值相近，且高于任何一次單因素試驗(yàn)，證明優(yōu)化得到的提取工藝準(zhǔn)確可靠。

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