劉 婷 歐陽(yáng)夢(mèng)云 王 燕 吳 佳 李 凱 劉賓翰
(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,湖南長(zhǎng)沙 410128;2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)東方科技學(xué)院,湖南長(zhǎng)沙 410128)
白藜蘆醇是一種非黃酮類(lèi)多酚化合物,具有酚和芪的特性,無(wú)味,白色針狀晶體,難溶于水,易溶于甲醇、乙醇、三氯甲烷、丙酮等有機(jī)溶劑。天然白藜蘆醇有順、反兩種結(jié)構(gòu),自然界中主要以反式構(gòu)象(生理活性強(qiáng)于順式異構(gòu)體)存在,且兩種結(jié)構(gòu)都可與葡萄糖結(jié)合,分別形成順式和反式白藜蘆醇糖苷[1]。研究發(fā)現(xiàn),白藜蘆醇具有抗炎、抗過(guò)敏、抗病原微生物[2]、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[3]、提高免疫功能[4]、降低血脂、抗血小板聚集[5]等多種生理活性,已被喻為繼紫杉醇后又一新的綠色抗癌藥物。白藜蘆醇主要存在于葡萄、虎杖、花生、桑椹、松樹(shù)等21個(gè)科、31個(gè)屬的72種植物中,在湖南、貴州等地的刺葡萄中含量較高[6]。
刺葡萄(V.didii.Foex)是中國(guó)南方主要野生葡萄品種之一,湖南湘西一帶擁有廣泛的刺葡萄野生資源。刺葡萄具有粒小、皮厚、色深和產(chǎn)量高等特點(diǎn),作為食用鮮果其市場(chǎng)受到一定限制[7],但適宜用于葡萄酒的釀造[8]。由于中國(guó)葡萄酒生產(chǎn)季節(jié)性強(qiáng)、生產(chǎn)集中,釀酒后的酒渣往往來(lái)不及處理就被隨意拋棄或作為廢料處理,造成了極大的環(huán)境污染和資源浪費(fèi),因此,從刺葡萄酒渣中提取有價(jià)值的活性物質(zhì),變廢為寶,具有重要的經(jīng)濟(jì)與環(huán)保效益。目前從刺葡萄酒渣中提取白藜蘆醇未見(jiàn)報(bào)道,本研究擬采用超聲輔助法從刺葡萄酒渣中提取白藜蘆醇,并對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,以期為刺葡萄的綜合開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。
刺葡萄酒渣:紫秋刺葡萄,湖南華淳莊園酒業(yè)有限公司;
反式白藜蘆醇苷標(biāo)準(zhǔn)品:純度>98.6%,成都曼思特生物科技有限公司;無(wú)水乙醇:分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;甲醇、乙腈:色譜純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
高效液相色譜儀:Agilent 1100 Series型,安捷倫科技有限公司;
電子分析天平:CP214型,奧豪斯儀器(上海)有限公司;
電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱:DHG-9240A型,上海飛越實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;
中草藥粉碎機(jī):FW177型,天津市泰斯特儀器有限公司;
數(shù)控超聲波清洗器:KQ-250DE型,昆山市超聲儀器有限公司。
1.3.1 原材料預(yù)處理 經(jīng)電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱50℃烘干,粉碎,過(guò)40目篩,4℃下避光儲(chǔ)藏,備用。
1.3.2 單因素試驗(yàn)
(1)溶劑(乙醇)濃度對(duì)白藜蘆醇提取率的影響:準(zhǔn)確稱(chēng)取5份1.000 g刺葡萄酒渣粉末,分別放于不同的100 mL棕色容量瓶中,在料液比1∶15(m∶V),超聲時(shí)間40 min,超聲溫度55℃的條件下,分別用20%,40%,60%,80%,99.7%的乙醇對(duì)刺葡萄酒渣中的白藜蘆醇進(jìn)行提取,快速濾紙過(guò)濾,再經(jīng)0.22 μm有機(jī)微孔濾膜后,用高效液相色譜測(cè)定白藜蘆醇含量。
(2)料液比對(duì)白藜蘆醇提取率的影響:準(zhǔn)確稱(chēng)取5份1.000 g刺葡萄酒渣粉末,分別放于不同的100 mL棕色容量瓶中,按料液比1∶10,1∶15,1∶20,1∶25,1∶30(m∶V)分別加入一定體積80%的乙醇,在55℃下超聲提取40 min,快速濾紙過(guò)濾,再經(jīng)0.22 μm有機(jī)微孔濾膜后,用高效液相色譜測(cè)定白藜蘆醇含量。
(3)超聲時(shí)間對(duì)白藜蘆醇提取率的影響:準(zhǔn)確稱(chēng)取6份1.000 g刺葡萄酒渣粉末,分別放于不同的100 mL棕色容量瓶中,用80%的乙醇在料液比1∶15(m∶V),55℃條件下,分別超聲提取 10,20,30,40,50,60 min,快速濾紙過(guò)濾,再經(jīng)0.22 μm有機(jī)微孔濾膜后,用高效液相色譜測(cè)定白藜蘆醇含量。
(4)超聲溫度對(duì)白藜蘆醇提取率的影響:準(zhǔn)確稱(chēng)取5份1.000 g刺葡萄酒渣粉末,分別放于不同的100 mL棕色容量瓶中,按料液比1∶15(m∶V)加入80%的乙醇,分別在25,40,55,70,85 ℃下超聲提取40 min,快速濾紙過(guò)濾,再經(jīng)0.22 μm有機(jī)微孔濾膜后,用高效液相色譜測(cè)定白藜蘆醇含量。
1.3.3 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,根據(jù)Box-Behnken原理,以白藜蘆醇提取率為響應(yīng)值,對(duì)料液比、超聲溫度、超聲時(shí)間進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì),運(yùn)用Design-Expert 8.0.5.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析優(yōu)化,得出刺葡萄酒渣中白藜蘆醇的最佳提取工藝。
1.3.4 白藜蘆醇提取率的測(cè)定
(1)色譜條件:參照GB/T 15038—2006,最終確定高效液相色譜測(cè)定條件為色譜柱:Agilent,ODS C18 hypersil(250 mm ×4.5 mm,5 μm);流動(dòng)相:乙腈 +重蒸水 =30%+70%;柱溫:21℃;流速:1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):306 nm;進(jìn)樣量:10 μL。
(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線制作:精確稱(chēng)取2.000 mg反式白藜蘆醇苷標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL棕色容量瓶中,加甲醇溶解,定容至刻度,得濃度為200 μg/mL的反式白藜蘆醇苷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別準(zhǔn)確吸取0.25,0.5,1,2,4 mL 于5 個(gè)不同的10 mL 棕色容量瓶中,用甲醇定容至刻度,搖勻得 5,10,20,40,80 μg/mL 的反式白藜蘆醇苷系列標(biāo)準(zhǔn)液。取10 μL在1.3.4(1)條件下進(jìn)樣,以吸收峰面積值(Y)為縱坐標(biāo),反式白藜蘆醇苷濃度(X)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程:
式中:
Y——白藜蘆醇苷吸收峰面積;
X——白藜蘆醇苷濃度,μg/mL。
(3)樣品測(cè)定:吸取待測(cè)液 10 μL,在 1.3.4(1)條件下測(cè)定,重復(fù)2次。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出待測(cè)液中白藜蘆醇苷的濃度,按式(2)計(jì)算提取率:
式中:
R——白藜蘆醇苷的提取率,μg/g;
C——待測(cè)液中白藜蘆醇苷的濃度,μg/mL;
V——提取溶劑的體積,mL;
M——樣品的質(zhì)量,g。
2.1.1 乙醇濃度對(duì)白藜蘆醇提取率的影響 由圖1可知,隨著乙醇濃度的增加,白藜蘆醇的提取率逐漸提高,當(dāng)提取劑乙醇濃度為80%時(shí),提取率達(dá)到最大值,繼續(xù)增加乙醇濃度,白藜蘆醇提取率反而略有下降。這可能是因?yàn)榘邹继J醇含有多個(gè)酚羥基,具有較大的極性,根據(jù)相似相溶原理,當(dāng)溶劑極性與白藜蘆醇極性相當(dāng)時(shí),白藜蘆醇溶解性大,提取率高。但乙醇濃度過(guò)高時(shí),大量脂溶性色素溶出,與白藜蘆醇競(jìng)爭(zhēng)溶劑分子,從而導(dǎo)致白藜蘆醇提取率略有下降。故選取80%乙醇為提取劑。
圖1 乙醇濃度對(duì)白藜蘆醇提取率的影響Figure 1 Effects of ethanol concentration on the extraction of resveratrol
2.1.2 料液比對(duì)白藜蘆醇提取率的影響 由圖2可知,在料液比為1∶10~1∶20(m∶V)時(shí),白藜蘆醇的提取率隨著溶劑體積的增加而增大,但當(dāng)料液比小于1∶20(m∶V)后,隨著溶劑體積的增大,白藜蘆醇的提取率反而降低。這是由于在提取過(guò)程中,刺葡萄酒渣粉末的質(zhì)量固定,當(dāng)溶劑體積較小時(shí),隨著溶劑的增加,有效成分與溶劑的接觸面積增大,從而使白藜蘆醇的提取率升高;但當(dāng)溶劑體積過(guò)大時(shí),超聲波輻射被溶劑大量吸收,穿透能力下降,作用于物料的有效輻射降低,從而影響有效成分的提?。?],同時(shí)溶劑體積過(guò)大會(huì)造成溶劑浪費(fèi)。故選取最佳料液比為1∶20(m∶V)。
2.1.3 超聲時(shí)間對(duì)白藜蘆醇提取率的影響 由圖3可知,隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng),白藜蘆醇的提取率上升,且在40 min內(nèi),增幅明顯。但提取時(shí)間超過(guò)40 min后,白藜蘆醇的提取率趨于平穩(wěn),甚至略有下降,這可能是由于超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng),空化效應(yīng)的作用力降低,也有可能是長(zhǎng)時(shí)間的超聲破壞了白藜蘆醇的結(jié)構(gòu),導(dǎo)致白藜蘆醇部分降解。故選取最佳提取時(shí)間為40 min。
圖2 料液比對(duì)白藜蘆醇提取率的影響Figure 2 Effects of solid/solvent ratio on the extraction of resveratrol
圖3 超聲時(shí)間對(duì)白藜蘆醇提取率的影響Figure 3 Effects of ultrasonic time on the extraction of resveratrol
2.1.4 超聲溫度對(duì)白藜蘆醇提取率的影響 由圖4可知,隨著超聲溫度的升高,白藜蘆醇的提取率逐漸提高,這是因?yàn)槌暅囟壬吣苁怪参锝M織軟化,提高有效成分的擴(kuò)散速度;當(dāng)溫度為55℃左右時(shí),提取率達(dá)到最大值,繼續(xù)提高超聲溫度,白藜蘆醇的提取率略有下降。且高溫會(huì)破壞白藜蘆醇的生理活性,故選取最佳超聲溫度為55℃。
圖4 超聲溫度對(duì)白藜蘆醇提取率的影響Figure 4 Effects of ultrasonic temperature on the extraction of resveratrol
2.2.1 響應(yīng)面分析試驗(yàn)結(jié)果 綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果,選取料液比、超聲溫度、超聲時(shí)間為響應(yīng)面優(yōu)化的三因素,對(duì)白藜蘆醇的提取率進(jìn)行分析,具體試驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表1、2。
表1 響應(yīng)面分析試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of RSM test
表2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis
運(yùn)用Design-Expert 8.0.5.0軟件對(duì)表2中試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析,得刺葡萄酒渣中白藜蘆醇的提取率與所選3個(gè)因素的二元多次回歸方程為:
對(duì)表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析,結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知,模型的F=86.81,P<0.000 1,表示模型顯著,且模型的失擬項(xiàng)P=0.175 8>0.05,不顯著,表明模型擬合度較好,殘差均由隨機(jī)誤差引起。模型的決定系數(shù)R2=0.991 1,表明響應(yīng)值白藜蘆醇提取率實(shí)際值與預(yù)測(cè)值之間具有良好的擬合度,調(diào)整系數(shù)Radj2=0.979 7,說(shuō)明該模型能用于解釋97.97%響應(yīng)值的變化,預(yù)測(cè)系數(shù)Rpred2=0.899 7,說(shuō)明該模型預(yù)測(cè)性良好[10,11],所以,該模型可用于刺葡萄酒渣中白藜蘆醇提取條件的分析和預(yù)測(cè)。且各因素的一次項(xiàng)和二次項(xiàng)的影響均為極顯著(P≤0.01),說(shuō)明各因素對(duì)刺葡萄酒渣中白藜蘆醇提取率的影響并非簡(jiǎn)單的線性關(guān)系[12]。根據(jù)各因素F值的大小可得,影響白藜蘆醇提取率的因素主次順序?yàn)?超聲時(shí)間>超聲溫度>料液比。
表3 響應(yīng)面結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of response surface results
表3 響應(yīng)面結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of response surface results
**表示影響極顯著,P≤0.01;*表示影響顯著,P≤0.05;N表示影響不顯著,P>0.05。
方差來(lái)源 平方和 自由度 均方 F值 P 值 顯著性模型 3 448.84 9 383.20 86.81 <0.000 1**A 319.79 1 319.79 72.45 <0.000 1 ** 3 479.74 16 B 30.90 7 4.41失擬項(xiàng) 20.83 3 6.94 2.76 0.175 8 N純誤差 10.07 4 2.52總和565.82 1 565.82 128.19 <0.000 1 **C 1 159.21 1 1 159.21 262.61 <0.000 1 **AB 0.71 1 0.17 0.038 0.850 8 N AC 27.04 1 27.04 6.13 0.042 5 *BC 5.71 1 5.71 1.29 0.292 7 N A2 444.01 1 444.01 100.59 <0.000 1 **B2 525.72 1 525.72 119.10 <0.000 1 **C2 260.72 1 260.72 59.07 0.000 1 **?dú)埐?/p>
2.2.2 響應(yīng)面交互作用分析 根據(jù)回歸方程,將其中任一因素固定在0水平??梢缘玫襟w現(xiàn)另外兩因素及其交互作用的響應(yīng)曲面圖[13](見(jiàn)圖5~7)。由圖5~7可知,沿時(shí)間軸向等高線變化最密集,且時(shí)間曲線最陡峭,說(shuō)明超聲時(shí)間對(duì)響應(yīng)值的影響最顯著[14],這與表3中根據(jù)各因素的F值大小得出的結(jié)論符合;分析等高線,結(jié)合表3中各因素的P值可知,超聲時(shí)間和料液比的交互作用顯著。
圖5為超聲時(shí)間為40 min時(shí),溫度和料液比及其交互作用對(duì)白藜蘆醇提取率影響的曲面圖。由圖5可知,當(dāng)料液比一定時(shí),隨著溫度的升高,白藜蘆醇的提取率呈先增高后降低的趨勢(shì);當(dāng)溫度一定時(shí),白藜蘆醇的提取率隨著溶劑體積的增大而先增大后平緩。
圖5 超聲溫度和料液比對(duì)白藜蘆醇提取率影響的響應(yīng)面Figure 5 Responsive surface and contours of the effect of temperature and solid/solvent ratio on the extraction rate of resveratrol
圖6為超聲溫度為55℃時(shí),超聲時(shí)間和料液比及其交互作用對(duì)白藜蘆醇提取率影響的曲面圖。由圖6可知,當(dāng)料液比一定時(shí),隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng),白藜蘆醇的提取率增大;當(dāng)超聲時(shí)間一定時(shí),隨著溶劑體積的增大,白藜蘆醇提取率先增大再減少,且增大的幅度并不大。
圖7為料液比為1∶15(m∶V)時(shí),超聲時(shí)間和溫度及其交互作用對(duì)白藜蘆醇提取率影響的曲面圖。由圖7可知,當(dāng)超聲時(shí)間一定時(shí),隨著溫度的升高,白藜蘆醇的提取先增大后略有減少;當(dāng)超聲溫度一定時(shí),白藜蘆醇的提取率隨超聲時(shí)間的增加而增加。
2.2.3 白藜蘆醇最優(yōu)工藝條件的確定與驗(yàn)證 在各因素選定范圍內(nèi),利用軟件Design-Expert 8.0.5.0對(duì)模型進(jìn)行分析優(yōu)化,預(yù)測(cè)出最優(yōu)提取條件為超聲溫度61.37℃,超聲時(shí)間48.67 min,料液比 1∶17.11(m∶V),且在該條件下白藜蘆醇提取率的預(yù)測(cè)值為191.63 μg/g。考慮到實(shí)際操作的方便,將提取工藝參數(shù)調(diào)整為:超聲溫度61℃,超聲時(shí)間49 min,料液比1∶17(m∶V),并在該條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),白藜蘆醇(以反式白藜蘆醇苷的形式存在)的平均提取率為 191.53 μg/g,與理論預(yù)測(cè)值 191.63 μg/g 接近,表明響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)得到的提取工藝參數(shù)可靠。
圖6 超聲時(shí)間和料液比對(duì)白藜蘆醇提取率影響的響應(yīng)面Figure 6 Responsive surface and contours of the effect of time and solid/solvent ratio on the extraction rate of resveratrol
圖7 超聲時(shí)間和溫度對(duì)白藜蘆醇提取率影響的響應(yīng)面Figure 7 Responsive surface and contours of the effect of time and temperature on the extraction rate of resveratrol
本研究在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,利用響應(yīng)面法對(duì)刺葡萄酒渣中白藜蘆醇的超聲輔助提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,并建立了白藜蘆醇提取率與超聲溫度、超聲時(shí)間、料液比3個(gè)因素的二次多項(xiàng)式回歸模型,通過(guò)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)證明該模型是科學(xué)可靠的。
本研究經(jīng)優(yōu)化得出超聲輔助提取刺葡萄酒渣中白藜蘆醇的最優(yōu)工藝為:超聲溫度61℃,超聲時(shí)間49 min,料液比1∶17(m∶V),此條件下白藜蘆醇(以反式白藜蘆醇苷的形式存在)的提取率為191.53 μg/g,與預(yù)測(cè)值相近,且高于任何一次單因素試驗(yàn),證明優(yōu)化得到的提取工藝準(zhǔn)確可靠。
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