劉 佳 丁 軻 陳湘寧， 王宗義， 許 麗， 郭振龍

(1.北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，北京 102206;2.食品質(zhì)量與安全北京實驗室，北京 102206;3.農(nóng)產(chǎn)品有害微生物及農(nóng)殘安全檢測與控制北京市重點實驗室，北京 102206)

辣根，別名西洋山崳菜、山葵蘿卜、馬蘿卜、青芥，為十字花科辣根屬多年生草本植物［1］。辣根中營養(yǎng)素豐富，并且富含硫代葡萄糖苷，具有很好的保健功能［2，3］。硫代葡萄糖苷(glucosinolate，GS)是一類廣泛存在于雙子葉植物中的含硫陰離子親水性次生代謝產(chǎn)物，具有防癌、抗菌等功效［4－6］。近年來的研究［7－9］表明硫苷分解產(chǎn)物異硫氰酸酯對哺乳動物的腎癌、前列腺癌、膀胱癌、結(jié)腸癌、直腸癌和肺癌等疾病都有一定的防御作用，有關(guān)植物中天然硫苷成分的研究也逐漸增多。烯丙基硫代葡萄糖苷的降解產(chǎn)物異硫氰酸烯丙酯在抑菌殺蟲方面有很大作用［10，11］，但研究大多針對總硫苷的提?。?2－15］，涉及烯丙基硫代葡萄糖苷提取工藝的研究較少，所以對烯丙基硫代葡萄糖苷提取工藝的研究也應(yīng)進(jìn)一步深入。中國的辣根資源豐富且沒有被充分利用，因此采用合適的提取方法提取辣根烯丙基硫代葡萄糖苷具有非常重要的理論意義及實用價值。

本研究通過建立一套有效的烯丙基硫代葡萄糖苷的高效液相色譜檢測方法，采用回流法和超聲輔助法分別提取辣根烯丙基硫代葡萄糖苷。通過對提取方法的比較研究，旨在找到最佳的提取工藝，從而提高烯丙基硫苷的提取率，為進(jìn)一步研究烯丙基硫代葡萄糖苷轉(zhuǎn)化烯丙基異硫氰酸酯奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

辣根粉:射陽縣天德食品有限公司;

氯化鋇、四甲基溴化銨:色譜純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;

無水乙醇:分析純，北京化工廠;

甲醇:色譜純，美國Fisher公司;

黑芥子硫苷酸鉀(sinigrin):純度≥99.0%，德國 Sigma公司;

電子天平:BSA223S型，賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司;

臺式低速離心機(jī):L530型，湖南赫西儀器裝備有限公司;

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器:RE-5203型，上海亞榮生化儀器廠;

循環(huán)水真空泵:SHZ-Ⅲ型，上海亞榮生化儀器廠;

集熱式恒溫加熱磁力攪拌器:DF-101S型，鄭州長城科工貿(mào)有限公司;

超聲循環(huán)提取機(jī):CTXNW-2B型，北京弘祥隆生物技術(shù)開發(fā)有限公司;

電冰箱:BCD-215DF型，青島海爾股份有限公司;

真空冷凍干燥機(jī):Alpha 1-2LD plus型，德國Christ公司;

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱:PHG-9246A型，上海精宏試驗設(shè)備有限公司;

超純水系統(tǒng):AWL-1002-U型，美國艾科浦國際公司;

電熱恒溫水浴鍋:HWS24型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司;

高效液相色譜儀:LC-20AD型，日本Shimadzu公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 烯丙基硫代葡萄糖苷分析方法的建立

(1)液相色譜條件:檢測器:PDA檢測器，檢測波長:226 nm，色譜柱:COSMOSIL Packed Column 5C18-MS-Ⅱ(4.6ID ×250 mm)，流動相:5 mmol/L四甲基溴化銨水溶液∶甲醇=19∶1(V∶V)［16］，梯度洗脫條件見表 1，流速:0.8 mL/min，柱溫:40 ℃，進(jìn)樣量:5 μL。

(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:準(zhǔn)確稱取4 mg Sinigrin標(biāo)準(zhǔn)品配制成2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液，將濃度分別稀釋到1.50，1.00，0.50，0.10，0.05，0.01 mg/mL。高效液相色譜法測定其峰面積，平行3次，以濃度(x)為橫坐標(biāo)，峰面積(y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖1)，所得回歸方程為:y=1 895.3x+82.033，R2=0.998 7。

表1 梯度洗脫條件表Table 1 The conditions of gradient elution

圖1 烯丙基硫代葡萄糖糖苷標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 The standard curve of allyl glucosinolates

(3)樣品中烯丙基硫代葡萄糖苷的測定:稱取烯丙基硫苷粗品50 mg，用超純水超聲溶解并定容至10 mL容量瓶中，臨用前用微濾膜(0.45 μm)過濾后，進(jìn)樣至HPLC中并測定其峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)一步換算出烯丙基硫代葡萄糖苷的濃度。由圖2可知，用該HPLC條件測烯丙基硫代葡萄糖苷是可行的，目標(biāo)峰和雜質(zhì)峰能夠完全分開，不會重合在一起。樣品中的目標(biāo)峰和烯丙基硫代葡萄糖苷標(biāo)品峰能夠基本重合，用該HPLC條件測定樣品中烯丙基硫代葡萄糖苷的含量是可行的。

圖2 烯丙基硫代葡萄糖苷色譜圖Figure 2 The chromatogram of allyl glucosinolates

1.2.2 提取工藝流程

辣根粉→過20目篩→110℃干燥4 h→溶劑回流提取(或超聲輔助提取)→抽濾→濾液加入0.4 mol/L乙酸鋇(按提取液體積的10%)→靜置30 min→8 000 r/min離心10 min→上清液50℃濃縮至約20 mL→真空冷凍干燥(10 Pa、－50℃)→烯丙基硫苷粗提物［17］

1.2.3 溶劑回流提取烯丙基硫代葡萄糖苷的工藝優(yōu)化

(1)單因素試驗設(shè)計:本試驗設(shè)計的各因素的固定參數(shù)為:乙醇濃度80%、提取溫度60℃、提取時間3 h、料液比1∶20(m∶V)，在其他條件保持一定的情況下，以烯丙基硫代葡萄糖苷提取率為評價指標(biāo)，分別選取乙醇濃度(50%，60%，70%，80%，90%)、提取溫度(40，50，60，70，80 ℃)、提取時間(1，2，3，4，5 h)和料液比(1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25(m∶V))進(jìn)行單因素試驗。

(2)正交試驗設(shè)計:在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用正交試驗設(shè)計方法對辣根中烯丙基硫代葡萄糖苷的溶劑回流法提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以乙醇濃度、提取溫度、提取時間和料液比為自變量［18，19］，以烯丙基硫代葡萄糖苷的提取率為指標(biāo)，設(shè)計四因素四水平的正交試驗，以進(jìn)一步優(yōu)化溶劑回流提取烯丙基硫代葡萄糖苷的工藝條件。

1.2.4 超聲波輔助提取烯丙基硫代葡萄糖苷的工藝優(yōu)化

(1)單因素試驗:由于超聲波提取裝置的容量限制，將料液比固定為1∶20(m∶V)。本試驗其它因素的固定參數(shù)設(shè)計為:乙醇濃度80%、超聲功率400 W、提取溫度40℃、超聲時間40 min，在其他條件保持一定的情況下，以烯丙基硫代葡萄糖苷提取率為評價指標(biāo)，分別選取乙醇濃度(50%，60%，70%，80%，90%)、超聲功率(200，300，400，500，600 W)、提取溫度(20，30，40，50，60 ℃)和超聲時間(20，30，40，50，60 min)進(jìn)行單因素試驗。

(2)正交試驗設(shè)計:為了綜合考慮多因素相互作用對超聲波提取烯丙基硫代葡萄糖苷的影響［20］，采用正交方法對辣根中烯丙基硫代葡萄糖苷的超聲輔助法提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以乙醇濃度、超聲功率、提取溫度、超聲時間為自變量，以烯丙基硫代葡萄糖苷的提取率為指標(biāo)，設(shè)計四因素三水平的正交試驗，以進(jìn)一步優(yōu)化超聲波輔助提取烯丙基硫代葡萄糖苷的工藝條件。

1.2.5 驗證對比實驗 通過數(shù)據(jù)分析獲得最佳提取工藝條件后，按照優(yōu)化條件進(jìn)行提取并測定烯丙基硫代葡萄糖苷的提取率，驗證預(yù)測值的準(zhǔn)確性。最后將溶劑回流提取法和超聲輔助提取法在最優(yōu)工藝條件下得到的烯丙基硫代葡萄糖苷進(jìn)行比較，選出最佳的提取方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶劑回流提取烯丙基硫代葡萄糖苷最優(yōu)工藝的確定

根據(jù)單因素試驗結(jié)果確定的正交試驗因素及水平取值見表2，試驗設(shè)計及結(jié)果見表3。

表2 正交試驗因素水平表Table 2 The level of orthogonal experiment factor

表3 L16(45)正交試驗結(jié)果直觀分析表Table 3 The design of orthogonal experiment L16(45)and results of intuitive analysis

2.1.1 直觀分析 由表3可知，在本試驗中乙醇濃度對烯丙基硫代葡萄糖苷提取效果的影響最大，提取溫度、提取時間、料液比條件在設(shè)定的試驗范圍內(nèi)對提取效果也均有影響。4因素對提取率影響的主次順序為:乙醇濃度＞提取溫度＞提取時間＞料液比，最佳因素組合為A3B3C3D4。

2.1.2 方差分析 對溶劑回流法正交試驗結(jié)果進(jìn)行方法分析，結(jié)果見表4。由表5可知，A因素(乙醇濃度)的F值極顯著，說明A因素對烯丙基硫代葡萄糖苷提取率有極顯著的影響。采用q值檢驗法對A因素各水平進(jìn)行多重比較，多重比較的結(jié)果為A3、A4、A2之間差異不顯著，但都與A1有顯著差異，與直觀分析結(jié)果相符，選定A3為最優(yōu)條件。最終結(jié)合直觀分析結(jié)果選定最佳工藝組合A3B3C3D4，即溶劑回流法提取辣根粉中烯丙基硫代葡萄糖苷的最優(yōu)工藝條件為:乙醇濃度80%，提取溫度65℃，提取時間3 h，料液比1∶20(m∶V)。

表4 方差分析表Table 4 Analysis of variance

表4 方差分析表Table 4 Analysis of variance

F0.05(3.3)=9.28;F0.01(3.3)=29.46。

變異來源 方差 自由度 均方差 F值A(chǔ) 2.604 3 3 0.868 1 32.758 5 3.436 7 15 ＊＊B 0.393 2 3 0.131 1 4.947 2 C 0.240 8 3 0.080 3 3.030 2 D 0.119 0 3 0.039 7 1.498 1 E(誤差) 0.079 4 3 0.026 5總變異

2.2 超聲輔助提取烯丙基硫代葡萄糖苷最優(yōu)工藝的確定

根據(jù)單因素試驗結(jié)果確定的正交試驗因素及水平取值見表5，試驗設(shè)計及結(jié)果見表6。

表5 正交試驗因素水平表Table 5 The level of orthogonal experiment factor

2.2.1 直觀分析 由表6可知，在本試驗中乙醇濃度對烯丙基硫代葡萄糖苷硫代葡萄糖苷提取效果的影響最大，水平十分顯著，超聲功率、提取溫度、超聲時間條件在設(shè)定的試驗范圍內(nèi)對提取效果也有一定影響。4因素對提取率影響的主次順序為:乙醇濃度＞提取溫度＞超聲功率＞超聲時間，最佳因素組合為A2B2C2D2。

2.2.2 方差分析 由直觀分析可以得出D因素(超聲時間)對提取效果的影響相對較小，將其作為誤差列，對上述數(shù)據(jù)進(jìn)行F檢驗，結(jié)果見表7。由表7可知，A因素(乙醇濃度)和C因素(提取溫度)的F值顯著，說明A因素和C因素對烯丙基硫代葡萄糖苷提取率有顯著影響，與直觀分析結(jié)果相符。最終結(jié)合直觀分析選定最佳工藝組合A2B2C2D2，即超聲法提取辣根粉中硫代葡萄糖苷的最優(yōu)工藝為:料液比1∶20(m∶V)，乙醇濃度75%，超聲功率400 W，提取溫度40℃，超聲時間40 min。

表6 L9(34)正交試驗設(shè)計及結(jié)果分析表Table 6 The design of orthogonal experiment L9(34)and results analysis

表7 方差分析表Table 7 Analysis of variance

表7 方差分析表Table 7 Analysis of variance

F0.05(2.2)=19;F0.01(2.2)=99。

變異來源 方差 自由度 均方差 F值A(chǔ) 0.691 1 2 0.345 6 69.12* B 0.016 3 2 0.008 2 1.64 C 0.220 4 2 0.110 2 22.04*D(誤差) 0.010 0 2 0.005 0總變異0.937 8 8

2.3 最優(yōu)提取工藝驗證及對比

分別在溶劑回流法最優(yōu)工藝:乙醇濃度80%，提取溫度65℃，提取時間3 h，料液比1∶20(m∶V)和超聲波輔助法最優(yōu)工藝:料液比1∶20(m∶V)，乙醇濃度75%，超聲功率400 W，提取溫度40℃，超聲時間40 min下進(jìn)行驗證實驗，結(jié)果見表8。

由表8可知，超聲波輔助法提取烯丙基硫代葡萄糖苷的提取率明顯高于溶劑回流法的提取率，并且超聲輔助提取法在時間縮短、溫度降低的情況下使烯丙基硫代葡萄糖苷的提取率將近提高了1.72倍。因此，本試驗選取超聲法為辣根中烯丙基硫代葡萄糖苷的最佳提取工藝，最佳條件為料液比1∶20(m∶V)，乙醇濃度75%，超聲功率400 W，提取溫度40℃，超聲時間40 min。

表8 兩種方法提取試驗結(jié)果Table 8 The extraction results of two methods

3 結(jié)論

本研究分別對溶劑回流法和超聲輔助法提取辣根中烯丙基硫代葡萄糖苷的兩種工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到溶劑回流法提取最佳工藝條件為:乙醇濃度80%，提取溫度65℃，提取時間3 h，料液比1∶20(m∶V)，此條件下試驗得到硫代葡萄糖苷提取率為2.528%;得到的超聲提取法最佳工藝條件為:料液比1∶20(m∶V)，乙醇濃度75%，超聲功率400 W，提取溫度40℃，超聲時間40 min，此條件下試驗得到的硫代葡萄糖苷提取率為4.342%。超聲波輔助提取烯丙基硫代葡萄糖苷的提取率是溶劑回流提取的1.72倍，時間縮短至2/9。相比傳統(tǒng)的溶劑回流法提取，不僅顯著縮短了提取時間，而且大大提高了提取效率，節(jié)省了成本，適合工業(yè)化生產(chǎn)，具有推廣應(yīng)用潛力。

此外，本研究建立了一套烯丙基硫代葡萄糖苷的高效液相檢測方法，可用于烯丙基硫代葡萄糖苷的定量分析，為單個硫苷物質(zhì)的檢測提供依據(jù)，為今后對烯丙基硫代葡萄糖苷及其水解產(chǎn)物異硫氰酸烯丙酯的研究及應(yīng)用提供試驗基礎(chǔ)。但本試驗只對辣根中的烯丙基硫代葡萄糖苷的提取工藝進(jìn)行研究，對烯丙基硫代葡萄糖苷的進(jìn)一步純化、穩(wěn)定性研究以及十字花科其他含有烯丙基硫代葡萄糖苷的植物的研究還有待深入。

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