梁 英 黃文樹 關(guān)瑞章

(1.集美大學水產(chǎn)學院，廈門 361021;2.集美大學鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)教育部工程研究中心，廈門 361021)

抗菌肽是普遍存在于生物體內(nèi)一類廣譜抗微生物的小分子多肽的總稱，通常其分子質(zhì)量小于10 ku?？挂痣牟粌H具有廣譜抗細菌的能力，對真菌、病毒以及寄生蟲等均有殺傷作用，是先天性免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分［1-3］?？咕牡淖饔眉皯?yīng)用效果是有目共睹的。然而，大多數(shù)內(nèi)源性抗菌肽在動物體內(nèi)的含量極其微少，難以獲得大量的樣品［4］。特別是在分離純化的后期，獲得的一些珍貴的單一蛋白質(zhì)樣品，其質(zhì)量僅為微克級，能用于檢測抗菌活性的蛋白質(zhì)的量則更少。因此，建立微量而敏感的抑菌試驗方法在內(nèi)源性抗菌肽的開發(fā)研究中極為重要。

關(guān)于抗菌肽抗菌活性測定的方法有很多，其中擴散法是最常規(guī)的方法，目前國內(nèi)外學者多采用此方法進行抗菌肽活性的檢測［5-6］。96孔細胞培養(yǎng)板稀釋法在檢測抗菌肽最低抑菌濃度的同時，可得到不同濃度抗菌肽對指示菌生長抑制作用的變化曲線［7-8］。生物自顯影法在達到活性跟蹤目的的同時還可以初步驗證單一抗菌活性組分［9］。這些方法都有各自的優(yōu)缺點，目前尚無統(tǒng)一的標準方法用于抗菌活性的檢測，基于分離材料、方法和階段的不同，關(guān)鍵是要選擇一種簡單易行、靈敏度高的方法。馬瑜等［10］比較了兩棲類皮膚抗菌肽抗菌活性檢測技術(shù)。鄔曉勇等［11］建立了一種在蛙皮抗菌肽分離純化過程中簡單、快速、靈敏的檢測抗菌活性的方法。齊珂珂等［12］建立了雞白細胞中抗菌肽的分離純化及活性鑒定方法。李秀蘭等［13］研究了家蠶抗菌肽瓊脂糖孔穴擴散法與比濁法測定抗菌活性的差異及其相關(guān)性。在魚類抗菌肽的分離過程中多采用抑菌圈法和微孔液體稀釋法檢測抗菌活性。Zhang等［14］采用抑菌圈法跟蹤分析大黃魚腎臟抗菌肽分離純化過程中純化蛋白質(zhì)抗菌活性的檢測。Lauth等［1］采用微孔液體稀釋法檢測抗菌肽moronecidin的抗菌活性。Fernandes等［15］采用雙層瓊脂擴散法檢測組蛋白H2A的抗菌活性。但目前專門針對魚類抗菌肽活性檢測技術(shù)比較研究的報道較少。Birkemo等［16］采用瓊脂板孔穴擴散法和微孔液體培養(yǎng)法2種方法檢測了hipposin和pleurocidin的抗菌活性，發(fā)現(xiàn)微孔液體培養(yǎng)法比瓊脂板孔穴擴散法更靈敏。因此，即使對同一種檢測對象而言，檢測方法不同表現(xiàn)出來的抗菌活性也不盡相同。本研究以日本鰻鱺脾臟小于10 ku的蛋白質(zhì)為抗菌肽樣品，探討了瓊脂板孔穴擴散法、微孔液體培養(yǎng)法及微量液體培養(yǎng)法這3種方法用于檢測抗菌肽抗菌活性的靈敏度，旨在建立一種比較靈敏、快速的抗菌活性檢測方法，為日本鰻鱺脾臟中新型抗菌肽的分離純化和鑒定奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要藥物和試劑

10 ku切向流中空纖維柱購自Amersham公司。冰醋酸、牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、氯化鈉等購自上?；瘜W試劑公司，均為分析純。

1.2 試驗菌株及菌液制備

遲鈍愛德華菌(Edwardsiella tarda，編號B09)、氣單胞菌(Aeromonas sp.，編號 B18)、嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila，編號 B27)均由本實驗室分離至患病鰻鱺，-80℃保存于本實驗室菌種庫，細菌編號為本庫編號。將3株菌分別接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板，30℃恒溫培養(yǎng)24 h，挑取平板上單菌落接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基斜面。用0.85%生理鹽水將斜面上的細菌苔洗脫，用酶標儀調(diào)節(jié)菌液濃度至1×108CFU/mL左右備用。

1.3 日本鰻鱺脾臟醋酸粗提物的制備及切向流超濾

選擇體重約500 g的日本鰻鱺，外觀無明顯病變和損傷，剖取鰻鱺脾臟，加入10倍體積的10%醋酸，用組織勻漿機勻漿后，用磁力攪拌器在4℃攪拌過夜，沸水浴10 min，迅速置冰上保存，設(shè)置離心溫度為4℃，8 000×g離心60 min，取上清液凍干。凍干樣品用超純水溶解后用10 ku切向流中空纖維柱超濾，整個系統(tǒng)壓力保持55～69 kPa，濾過的蛋白質(zhì)即為脾臟中分子質(zhì)量小于10 ku的抗菌肽樣品，冷凍干燥備用。

1.4 3種抗菌活性檢測方法的比較

將從日本鰻鱺脾臟中提取的小于10 ku的抗菌肽樣品用超純水溶解，配制成1 200μg/mL的儲備液，蛋白質(zhì)濃度測定參照Bradford［17］的方法。3 種檢測方法均設(shè)置了 60、30、20、10、7、4 和 2 μL 7個加樣體積，對應(yīng)的蛋白質(zhì)質(zhì)量分別為Q1(72.0 μg)、Q2(36.0 μg)、Q3(24.0 μg)、Q4(12.0 μg)、Q5(8.4 μg)、Q6(4.8 μg)和 Q7(2.4μg)。3種方法中，上述選取的3株菌均設(shè)置105和104CFU/mL 2個細菌濃度。

1.4.1 瓊脂板孔穴擴散法檢測抗菌活性

取15μL 1×108CFU/mL菌液加入平皿內(nèi)，待培養(yǎng)基冷卻至45℃，將培養(yǎng)基倒入平皿，每個平皿約15 mL，置水平位置迅速旋動平皿，使培養(yǎng)基和菌液充分混勻，分別制備3株致病菌的檢測平板，細菌濃度為 105CFU/mL。取 1.5 μL 1×108CFU/mL菌液以同樣方法分別制備3株致病菌的檢測平板，使細菌濃度為104CFU/mL。每個平板內(nèi)打8個孔(孔徑為5 mm)，標記后，在第1～7孔內(nèi)分別加入與7個蛋白質(zhì)質(zhì)量相對應(yīng)體積(分別為60、30、20、10、7、4 和2 μL)的抗菌肽樣品，第8個孔加入60μL 0.85%生理鹽水作為陰性對照，28℃培養(yǎng)24 h后觀察并測量抑菌圈大小，記錄試驗結(jié)果。每個蛋白質(zhì)質(zhì)量的抗菌肽樣品做3個重復。

1.4.2 微孔液體培養(yǎng)法檢測抗菌活性

參照Anderson等［18］的方法略加修改。在96孔細胞培養(yǎng)板的孔中分別加入與7個蛋白質(zhì)質(zhì)量相對應(yīng)體積的抗菌肽樣品和同樣體積的菌液，即60μL抗菌肽樣品+60μL菌液、30μL抗菌肽樣品+30μL菌液……;在對照孔中加入相應(yīng)體積的0.85%生理鹽水和同樣體積的菌液，即 60μL 0.85%生理鹽水+60 μL 菌液、30 μL 0.85%生理鹽水+30μL菌液……。設(shè)置2個細菌濃度，分別為105和104CFU/mL。將細胞培養(yǎng)板置28℃培養(yǎng)1 h，而后每孔中分別加入與7個蛋白質(zhì)質(zhì)量對應(yīng)體積的無菌MHB培養(yǎng)基，即試驗孔:60μL抗菌肽樣品+60μL菌液+60μL無菌MHB培養(yǎng)基、30μL抗菌肽樣品+30μL菌液+30μL無菌MHB培養(yǎng)基……;對照孔:60μL 0.85%生理鹽水+60μL菌液+60μL無菌 MHB培養(yǎng)基、30μL 0.85%生理鹽水+30μL菌液+30μL無菌MHB培養(yǎng)基……。28℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，在酶標儀上檢測600 nm處的吸光度值(A600)。每個蛋白質(zhì)質(zhì)量的抗菌肽樣品做3個重復。按下列公式計算抑菌指數(shù):

1.4.3 微量液體培養(yǎng)法檢測抗菌活性

參照陸婕等［19］方法進行適當改進。試驗組:取與7個蛋白質(zhì)質(zhì)量相對應(yīng)體積的抗菌肽樣品和同樣體積的菌液混合，即60μL抗菌肽樣品+60μL菌液、30μL抗菌肽樣品+30μL菌液……;對照組:取相應(yīng)體積的0.85%生理鹽水和同樣體積的菌液混合，即60μL 0.85%生理鹽水+60μL菌液、30μL 0.85%生理鹽水+30μL菌液……。設(shè)置2個細菌濃度，分別為105和104CFU/mL。28℃孵育1 h，期間將普通培養(yǎng)基熔化后倒平板，待其凝固，分別取試驗組和對照組的混合液點樣于普通培養(yǎng)基上，盡量涂布均勻，28℃培養(yǎng)24 h后，分別計算試驗組和對照組培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)(N)。每個蛋白質(zhì)質(zhì)量的抗菌肽樣品做3個重復。按下列公式計算殺傷指數(shù):

殺傷指數(shù)(%)=(1-試驗組N/對照組N)×100。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)用平均值±標準誤(mean±SE)表示，采用SPSS 13.0軟件進行單因素方差分析(oneway ANOVA)和 Duncan氏法檢驗，以P＜0.05為差異顯著，P＞0.05為差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 瓊脂板孔穴擴散法檢測抗菌活性

60μL抗菌肽樣品對105和104CFU/mL 2個濃度的B09、B18和B27菌株表現(xiàn)出最強的抗菌活性，其次為30μL，從20μL開始逐漸遞減體積的樣品對3株菌均無抗菌活性。60和30μL的抗菌肽樣品對濃度為105CFU/mL的B09菌株的平均抑菌圈半徑分別為3.0和1.0 mm;對濃度為105CFU/mL的B18菌株的平均抑菌圈半徑分別為4.0和0 mm;對濃度為105CFU/mL的 B27菌株的平均抑菌圈半徑分別為3.0和2.0 mm(表1)。60和30μL抗菌肽樣品對濃度為104CFU/mL的B09菌株的平均抑菌圈半徑分別為3.0和0 mm;對濃度為104CFU/mL的 B18菌株的平均抑菌圈半徑分別為4.0和2.0 mm;對濃度為104CFU/mL的B27菌株的平均抑菌圈半徑分別為 4.0 和 3.1 mm(表 2)。對照組中 0.85%生理鹽水對105和104CFU/mL 2種濃度的 B09、B18和B27菌株均無抗菌活性。

表1 7個體積的抗菌肽樣品對105 CFU/mL B09、B18和B27菌株的抗菌活性(以抑菌圈半徑表示)Table 1 Antibacterial activities of antibacterial peptide samples with seven kinds of volume against 105 CFU/mL B09，B18 and B27 strains(represented by radius of inhibitory ring) mm

表2 7個體積的抗菌肽樣品對104 CFU/mL B09、B18和B27菌株的抗菌活性(以抑菌圈半徑表示)Table 2 Antibacterial activities of antibacterial peptide samples with seven kinds of volume against 104 CFU/mL B09，B18 and B27 strains(represented by radius of inhibitory ring) mm

2.2 微孔液體培養(yǎng)法檢測抗菌活性

在此方法中，與10、7、4和2μL抗菌肽樣品相對應(yīng)的加樣體積，即10μL抗菌肽樣品+10μL菌液+10μL MHB培養(yǎng)基(共30μL)、7μL抗菌肽樣品+7μL菌液+7μL MHB培養(yǎng)基(共21μL)、4μL抗菌肽樣品+4μL菌液+4μL MHB培養(yǎng)基(共12μL)、2μL抗菌肽樣品+2μL菌液+2μL MHB培養(yǎng)基(共6μL)，未能覆蓋滿孔底，當用酶標儀進行檢測時這4組數(shù)據(jù)受干擾較大，而以肉眼判斷的結(jié)果不準確，無法對其分析。60、30、20μL 3個體積的抗菌肽樣品對濃度為105CFU/mL的B09、B18和B27菌株的抗菌活性高于對濃度為104CFU/mL的對應(yīng)菌株的抗菌活性，且這3個體積的抗菌肽樣品對2種濃度的B09菌株的抗菌活性明顯低于B18和B27菌株，3個體積的抗菌肽樣品對2個濃度的B18和B27菌株的抗菌活性大體呈現(xiàn)為:30μL＞60μL＞20μL。當待試菌濃度為105CFU/mL時，對于B09菌株，60和30μL 2個體積的抗菌肽樣品的抗菌活性顯著低于20μL體積的抗菌肽樣品(P＜0.05);對于B18和B27菌株，60和20μL 2個體積的抗菌肽樣品的抗菌活性顯著低于30μL體積的抗菌肽樣品(P＜0.05)(表 3)。 當 待 試 菌 濃 度 為104CFU/mL時，對于 B09菌株，60和30μL 2個體積的抗菌肽樣品的抗菌活性無顯著差異(P＞0.05)，但二者均顯著低于20μL體積的抗菌肽樣品(P＜0.05);對于 B18菌株，60和 30 μL 2個體積的抗菌肽樣品的抗菌活性顯著高于20μL體積的抗菌肽樣品(P＜0.05);對于 B27菌株，60和20μL 2個體積的抗菌肽樣品的抗菌活性顯著低于30μL體積的抗菌肽樣品(P＜0.05)(表4)。對照孔中均見到彌散渾濁細菌沉淀，表現(xiàn)為無抗菌活性。

表3 3個體積的抗菌肽樣品對105 CFU/mL B09、B18和B27菌株的抗菌活性(以抑菌指數(shù)表示)Table 3 Antibacterial activities of antibacterial peptide samples with three kinds of volume against 105 CFU/mL B09，B18 and B27 strains(represented by antibacterial index) %

表4 3個體積的抗菌肽樣品對104 CFU/mL B09、B18和B27菌株的抗菌活性(以抑菌指數(shù)表示)Table 4 Antibacterial activities of antibacterial peptide samples with three kinds of volume against 104 CFU/mL B09，B18 and B27 strains(represented by antibacterial index) %

2.3 微量液體培養(yǎng)法檢測抗菌活性

在此方法中，與 60、30、20、10 μL 抗菌肽樣品相對應(yīng)的加樣體積，即60μL抗菌肽樣品+60μL菌液(共120μL)、30μL抗菌肽樣品+30μL菌液(共60μL)、20μL抗菌肽樣品+20μL菌液(共40μL)、10μL 抗菌肽樣品+10μL 菌液(共20μL)，因加樣體積太大，不能在一個瓊脂培養(yǎng)板上同時點樣，故無法檢測抗菌活性。7、4和2μL的抗菌肽樣品對濃度為105CFU/mL的B09、B18和B27菌株的殺傷指數(shù)均為0。7μL的抗菌肽樣品對濃度為104CFU/mL的B09、B18和B27菌株的殺傷指數(shù)分別為0、50%和40%，抗菌活性大體呈現(xiàn)為:B18＞B27＞B09，4和 2μL的抗菌肽樣品對濃度為104CFU/mL的B09、B18和B27菌株均無抗菌活性。對照組中濃度為105和104CFU/mL的B09、B18和B27菌株在培養(yǎng)基上生長良好。

3 討論

瓊脂板孔穴擴散法中，60μL(72μg)的抗菌肽樣品對濃度分別為105和104CFU/mL的B09、B18和B27這3個菌株均表現(xiàn)出最強的抗菌活性，其次為30μL(36μg)，但后者的抑菌圈大小不明顯。從20μL(24μg)開始逐漸遞減體積的抗菌肽樣品對上述3個菌株均無抗菌活性。微孔液體培養(yǎng)法中，60和30μL的抗菌肽樣品對濃度分別為105和104CFU/mL的3個菌株均表現(xiàn)出較強的抑菌活性，其中對B18和B27菌株的抑菌指數(shù)基本達到55%以上;20μL的抗菌肽樣品對3個菌株仍表現(xiàn)出較強的抗菌活性。同樣蛋白質(zhì)質(zhì)量的抗菌肽樣品在上述2種檢測方法中表現(xiàn)出來的抗菌活性有明顯差異，產(chǎn)生此差異的原因可能有2個方面:一方面，在制作瓊脂板時，由于培養(yǎng)基厚度難以準確控制，經(jīng)常導致同一培養(yǎng)皿中各點的厚薄不均，由此產(chǎn)生抑菌圈大小和抗菌肽量不成比例［20-21］;另一方面，以往的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)水溶性好的小分子物質(zhì)在瓊脂板孔穴擴散法中具有很好的擴散行為，而對于抗菌肽類大分子則表現(xiàn)為擴散能力有限，往往得不到較好的結(jié)果，這是因為抗菌肽實現(xiàn)其活性的空間結(jié)構(gòu)可能被瓊脂抑制，影響其真正地發(fā)揮出對細菌的抑制作用［11，22］。此外，在微孔液體培養(yǎng)法中，抗菌肽能直接與檢測菌接觸，克服了抗菌肽因分子結(jié)構(gòu)復雜而無法在瓊脂孔中快速擴散的問題，能夠比較準確的反映抗菌肽的真實抗菌活性［11］。從加樣體積上看，選擇瓊脂板孔穴擴散法檢測抗菌活性存在樣品需要量大、靈敏度低的缺陷。但是，相對來說其具有操作比較簡單、試驗結(jié)果直觀的優(yōu)點，在抗菌肽粗提階段樣品量較多且對樣品抗菌活性的精確度要求不高時，可以選擇這種方法。

傳統(tǒng)的微孔液體培養(yǎng)法主要借助儀器進行檢測，即通過檢測550或600 nm處的吸光度確定抗菌肽的抗菌活性［23-25］。在本試驗中，與 10、7、4、2μL抗菌肽樣品相對應(yīng)的加樣體積未覆蓋滿孔底，采用酶標儀對其吸光度進行檢測時，這4組數(shù)據(jù)受干擾較大，無法準確判斷結(jié)果。由此可見，微孔液體培養(yǎng)法對于樣品量的需求也必須要滿足一定的體積。在試驗過程中發(fā)現(xiàn)60、30和20μL 3個體積的抗菌肽樣品對濃度為105CFU/mL的B09、B18和B27這3個菌株的抑菌活性反而高于濃度為104CFU/mL的對應(yīng)菌株，推測在這種檢測方法中，抗菌肽與菌液是直接接觸的，被抗菌肽殺滅的細菌和存活的細菌以及抗菌肽與細菌相互作用后的產(chǎn)物均留在微量孔中，通過測量試驗孔和對照孔的吸光度，以吸光度的差值來確定抗菌肽的抗菌活性，在抗菌活性的判斷上難免產(chǎn)生干擾和誤差［13］。此外，試驗還發(fā)現(xiàn) 60、30和 20μL 3個體積的抗菌肽樣品對2個濃度的3個菌株的抗菌活性不是理論上的逐漸減弱，而是出現(xiàn)了明顯的波動。對于2個濃度的B09菌株，60和30μL的抗菌肽樣品的抑菌活性顯著低于20μL的抗菌肽樣品;而對于2個濃度的B27菌株，60和20μL的抗菌肽樣品的抑菌活性顯著低于30μL的抗菌肽樣品。出現(xiàn)這樣一個明顯差異的原因，推斷可能是由于抗菌肽與不同細菌之間最佳的作用點不同，對此機理還需要進一步研究。因此，微孔液體培養(yǎng)法的靈敏度和準確度欠佳，并且此法需使用細胞培養(yǎng)板，成本較高，但是這種方法能夠同時在一塊細胞培養(yǎng)板上處理大批樣品，在目前抗菌肽的抗菌活性檢測中還是得到了廣泛的應(yīng)用。

微量液體培養(yǎng)法在傳統(tǒng)的瓊脂板孔穴擴散法和微孔液體培養(yǎng)法的基礎(chǔ)上，既克服了瓊脂板孔穴擴散法中抗菌肽類大分子在瓊脂中擴散有限的缺點，也彌補了微孔液體培養(yǎng)法準確度欠佳的缺陷。此方法中，抗菌肽和細菌雖然也是直接接觸，但是試驗中是將抗菌肽和細菌的混合液先孵育后再點樣于瓊脂板上，這樣只有存活下來的細菌會在瓊脂板上生長，排除了死菌和作用產(chǎn)物的干擾，試驗結(jié)果簡單明了且準確性高。陸婕等［19］采用微量液體培養(yǎng)法用于測量最低抑菌濃度和分析殺菌能力，試驗組中以沒有長出菌落的對應(yīng)樣品的終濃度即為該樣品對該菌的最低抑菌濃度，以有無長菌判斷是否有殺菌能力。本試驗中，作者對此方法進行適當改進，試驗組與對照組的混合液點樣于培養(yǎng)基上后，在此增加一個重要步驟，即對混合液進行均勻涂布，這樣在培養(yǎng)一定時間后，可以分別數(shù)出試驗組和對照組在培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)，從而較精確的計算出殺傷指數(shù)。因此，通過這樣的改進，不僅可以對抗菌活性做定性分析，還可以進行定量分析。

從加樣體積上看，本試驗在3種檢測方法中均設(shè)置了抗菌肽的最大加樣量60μL，以保證試驗的同步性和平行性。但在微量液體培養(yǎng)法中，要在1塊瓊脂板的空間上同時點樣60μL抗菌肽樣品+60μL菌液(共120μL)、30μL抗菌肽樣品+30μL菌液(共60μL)、20μL抗菌肽樣品+20μL菌液(共40μL)、10μL抗菌肽樣品+10μL菌液(共20μL)，則超過了1塊瓊脂培養(yǎng)板所承受的最大點樣體積。換言之，微量液體培養(yǎng)法不需要如此多體積的樣品。相反，小劑量樣品(7μL抗菌肽樣品+7μL菌液)表現(xiàn)出對濃度為104CFU/mL的B18和B27菌株均有抗菌活性。采用此方法，僅需8.4μg的抗菌肽樣品就能獲得明顯的抗菌活性，樣品需求量大大少于瓊脂板孔穴擴散法和微孔液體培養(yǎng)法。但是，選擇此方法需要指出的一個關(guān)鍵性的問題就是對菌液濃度的選擇。因此，在本試驗的3種檢測方法中，對3個菌株均設(shè)置了105和104CFU/mL 2個細菌濃度。7μL抗菌肽樣品對濃度為105CFU/mL的3個菌株均無抗菌活性，對濃度為104CFU/mL的B18和B27菌株有抗菌活性。這可能是微量體積的抗菌肽在面對濃度為104CFU/mL的菌液時，其中的抗菌肽分子尚能夠?qū)辜毦?，而當單位體積中的細菌數(shù)增加時，此時抗菌肽分子不足以對抗如此多的細菌，表現(xiàn)出無抗菌活性。當然，也不是細菌的濃度越低越好，有研究曾經(jīng)選擇更低濃度的菌液進行試驗，由于細菌的生長也是群居性的，當單位體積中細菌數(shù)太少時，對照組的細菌在瓊脂板上本身就不生長，從而無法比較試驗結(jié)果［26］。

4 結(jié)論

通過對3種方法的比較發(fā)現(xiàn)，微量液體培養(yǎng)法比瓊脂板孔穴擴散法和微孔液體培養(yǎng)法所需抗菌肽樣品量少，且具有很高的靈敏度和準確性。該方法對分離純化并鑒定純度高、樣品量少的抗菌肽的抗菌活性有著重要的應(yīng)用價值，適用于日本鰻鱺脾臟中抗菌肽抗菌活性的檢測。

［1］ LAUTH X，SHIKE H，BUMSJC，et al.Discovery and characterization of two isoforms of moronecidin，a novel antimicrobial peptides from hybrid striped bass［J］.The Journal of Biological Chemistry，2002，277(7):5030-5039.

［2］ 梁英.抗菌肽的來源及應(yīng)用［J］.動物營養(yǎng)學報，2014，26(1):7-16.

［3］ 黎觀紅，洪智敏，賈永杰，等.抗菌肽的抗菌作用及其機制［J］.動物營養(yǎng)學報，2011，23(4):546-555.

［4］ 岳昌武，莫寧萍，劉坤祥，等.抗菌肽的結(jié)構(gòu)特點·作用機理及其應(yīng)用前景［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2008，36(5):1736-1739.

［5］ 金莉莉，丁忠福，王秋雨.中國林蛙皮抗菌肽提取條件的優(yōu)化研究［J］.食品科學，2008，29(10):223-227.

［6］ 賴仞，葉文娟，冉永祿，等.大蹼鈴蟾皮膚分泌液中抗菌活性肽的分離純化及其性質(zhì)［J］.動物學研究，1998，19(4):257-262.

［7］ SIMMACO M，MIGNOGNA G，BARRA D.Antimicrobial peptides from amphibian skin:what do they tell us?［J］Biopolymers:Peptide Science，1998，47(6):435-450.

［8］ SONNER A，KNOOP F C，PATEL M，et al.Antimicrobial properties of the frog skin peptide，ranatuerin-1 and its ［Lys28］ substituted analog［J］.Peptides，2004，25(1):29-36.

［9］ 鄧小娟，曹陽，鐘仰進，等.SDS-PAGE凝膠原位檢測抗菌蛋白的活性——生物自顯影技術(shù)［J］.西南農(nóng)業(yè)大學學報:自然科學版，2005，27(1):136-137.

［10］ 馬瑜，孫燕，李治.兩棲類皮膚抗菌肽的分離純化與抗菌活性檢測技術(shù)［J］.藥物生物技術(shù)，2010，17(1):83-86.

［11］ 鄔曉勇，何鋼，顏軍，等.抗菌肽抑菌活性測定方法的研究［J］.生物學通報，2011，46(4):4-7.

［12］ 齊珂珂，康相濤，李國喜，等.雞白細胞中抗菌肽的分離純化及活性鑒定方法的建立［J］.西北農(nóng)林科技大學學報:自然科學版，2008，36(9):27-39.

［13］ 李秀蘭，戴祝英，張雙全.抗菌肽瓊脂糖孔穴擴散法與比濁法測活比較及其相關(guān)性［J］.南京師大學報:自然科學版，1998，21(2):81-83.

［14］ ZHANG J J，YAN Q P，JI R X，et al.Isolation and characterization of a hepcidin peptide from the head kidney of large yellow croaker，Pseudosciaena crocea［J］.Fish ＆ Shellfish Immunology，2009，26(6):864-870.

［15］ FERNANDES J M O，MOLLE G，KEMP G D，et al.Isolation and characterization of oncorhyncinⅡ，a histone H1-derived antimicrobial peptide from skin secretions of rainbow trout，Oncorhynchus mykiss［J］.Developmental and Comparative Immunology，2004，28(2):127-138.

［16］ BIRKEMO G A，LüDERS T，ANDERSEN ?，et al.Hipposin，a histone-derived antimicrobial peptide in Atlantic halibut(Hippoglossus hippoglossus L.)［J］.Biochimica et Biophysica Acta，2003，1646(1/2):207-215.

［17］ BRADFORD M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding［J］.Analytical Biochemistry，1976，72(1/2):248-254.

［18］ ANDERSON R S，BEAVEN A E.Antibacterial activities of oyster(Crassostrea virginica)and mussel(Mytilus edulis and Geukensia demissa)plasma［J］.Aquatic Living Resources，2001，14(6):343-349.

［19］ 陸婕，汪俊漢，鐘雅，等.弱酸性家蠅蛆抗菌肽MD7095的分離純化及性質(zhì)研究［J］.微生物學報，2006，46(3):406-411.

［20］ 夏明明，徐上，李偉，等.高敏感薄層平板抗菌肽活性檢測［J］.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報，1995，3(2):19-24.

［21］ 吳琦，楊美薷，鐘德鈺，等.瓊脂糖彌散抗菌實驗在檢測腮腺唾液抗菌活性中的應(yīng)用［J］.華西口腔醫(yī)學雜志，1995，13(3):201-206.

［22］ 鄔曉勇，何鋼，顏軍，等.蛙皮抗菌肽活性檢測方法的篩選及其分離純化［J］.西南農(nóng)業(yè)學報，2011，24(4):1564-1567.

［23］ ISSACSON T，SOTO A，IWAMURO S，et al.Antimicrobial peptides with atypical structural features from the skin of the Japanese brown frog Rana japonica［J］.Peptides，2002，23(3):419-425.

［24］ LIANG Y，GUAN R Z，HUANG W S，et al.Isolation and identification of a novel inducible antibacterial peptide from the skin mucus of Japanese eel，Anguilla japonica［J］.The Protein Journal，2011，30(6):413-421.

［25］ HUANG W S，WANG K J，YANG M，et al.Purification and part characterization of a novel antibacterial protein scygonadin，isolated from the seminal plasma of mud crab，Scylla serrata(Forsk?l，1775)［J］.Journal of Experimental Marine Biology and Ecology，2006，339(1):37-42.

［26］ 沈萍，陳向東.微生物學［M］.北京:高等教育出版社，2006:130-135.